研究背景及目的:间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）属于多能干细胞,具有良好的增殖能力及多向分化潜能,其在特定的诱导条件下,可向多种细胞定向分化,继而分化成骨、软骨、肌肉、脂肪等组织。在再生医学领域,间充质干细胞被作为理想的种子细胞用于骨组织工程,主要应用于骨质疏松、难愈合性骨折等疾病的治疗。永生化小鼠胚胎成纤维细胞（immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF）具备间充质干细胞相关生物特性,具有自我更新和多向分化潜能,同时可以通过质粒转染或基因改造来表达异位基因,是分析基因功能的合适的细胞模型,多被用作为骨髓间充质干细胞的代生干细胞模型,以研究中胚层细胞的分化机制。黏着斑激酶（Focal adhesion kinase,FAK）是胞质内非受体蛋白酪氨酸激酶,集中在粘着斑附近,通过整合来自细胞外压力、营养、细胞黏着等多方面的信号,参与调控多条信号转导通路,调节细胞迁移和血管生成,尤其在肿瘤细胞的进展和转移中起重要作用。此外,目前已证实的参与影响成骨细胞成骨分化过程的相关物理因素如磁场、超声波等,化学因子如一氧化氮、组蛋白H1等及生物力学作用,多可由黏着斑激酶整合。值得一提的是,研究表明黏着斑激酶在胚胎干细胞及整个胚胎发育过程中均可表达,在调节胚胎干细胞的增殖、指导干细胞谱系分化的过程中起到关键作用。目前关于黏着斑激酶与成骨细胞成骨分化的研究绝大多数集中在生物力学等细胞外信号是否由黏着斑激酶整合进而影响成骨细胞成骨分化,然而在经过整合相关细胞外信号后,黏着斑激酶通过何种方式影响胚胎干细胞成骨分化尚缺乏研究证实。本课题就敲除黏着斑激酶后是否降低胚胎干细胞的成骨效应,以及黏着斑激酶如何调控胚胎干细胞成骨分化两个科学问题,通过对具有多向分化潜能的小鼠胚胎成纤维细胞进行定向诱导成骨分化,并施以相关处理,探索黏着斑激酶在诱导小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化过程中的作用及机制。研究方法:1、对iMEF^FAK+/+细胞、iMEF^FAK-/-细胞形态及功能有效鉴定。2、在相同的诱导条件下,诱导iMEF^FAK+/+细胞、iMEF^FAK-/-细胞成骨分化。3、在相同的诱导条件下,诱导加入PI3K/AKT磷酸化抑制剂LY294002和MEK/ERK_1/2磷酸化抑制剂U0126处理的iMEF^FAK+/+细胞、iMEF^FAK-/-细胞成骨分化。4、在显微镜下观察不同的诱导时期细胞形态的改变。5、Western blot技术检测诱导前期RUNX2蛋白表达水平及相应的P-AKT、P-ERK_1/2表达水平。6、qRT-PCR技术检测诱导前期RUNX2基因转录水平。7、在成骨诱导21天后对诱导细胞进行茜素红钙结节染色。研究结果:1、相同的诱导条件下,iMEF^FAK-/-细胞的成骨效应较iMEF^FAK+/+细胞明显下降。2、iMEF^FAK-/-细胞PI3K p85（Y458）、AKT（Ser473）、ERK_1/2（Thr202/Tyr204）分子磷酸化水平相对于iMEF^FAK+/+细胞均有不同程度的下降。3、经PI3K/AKT磷酸化抑制剂LY294002处理的iMEF^FAK+/+细胞、iMEF^FAK-/-细胞与对照组相比成骨效应明显下降。4、经MEK/ERK_1/2磷酸化抑制剂U0126处理的iMEF^FAK+/+细胞、iMEF^FAK-/-细胞与对照组相比成骨效应明显下降。研究结论:1、静默黏着斑激酶表达明显降低小鼠胚胎成纤维细胞的成骨效应。2、黏着斑激酶可通过改变PI3K/AKT、ERK_1/2磷酸化水平影响小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化。