论文部分内容阅读
氮素是植物生长发育所必需的三大营养元素之一,土壤中的氮素含量较低,是限制作物生长的主要因素,也影响着作物的产量和品质。为挖掘与氮素吸收利用相关的关键基因,本研究通过转录组分析技术,获得了低氮胁迫响应氯离子通道蛋白TaCLC家族基因,结合小麦数据库对TaCLC基因家族进行鉴定,采用生物信息学方法对TaCLC家族基因进行分析,运用酵母突变体和拟南芥对部分基因的功能进行分析,并对TaCLCs的互作蛋白和上游调控转录因子进行鉴定,主要结果如下:（1）利用转录组技术分析小麦幼苗在氮饥饿胁迫条件下差异基因的表达,分析差异表达基因的表达模式,采用GO和KEGG数据库对差异基因进行比对注释,在转录组数据中发现了与氮素吸收利用相关的小麦TaCLC家族基因,获得了该家族基因响应氮饥饿的转录表达谱。（2）以拟南芥的CLC基因为参考序列,利用电压门控氯离子通道HMM模型对小麦基因组数据库进行Blastp搜索,获得23个TaCLC基因序列。对该家族进行系统发育分析,TaCLC基因家族基因主要分为2个亚类（Ⅰ,Ⅱ）和7个簇（-a,-c1,-c2,-e,-f1,-f2,-g2）。TaCLC家族基因在小麦染色体A基因组（8个）,B基因组（7个）和D基因组（8个）上的分布较为均衡,且大部分同源基因存在共线性关系。部分同源基因之间不存在共线性关系,说明该家族基因在进化过程中,同源基因的片段丢失和基因丢失同时发生。基因结构、蛋白结构和保守motif分析表明TaCLCs基因含有3-8个内含子,4-9个外显子和8-12个跨膜区域,对于同一簇同源基因而言,其motif结构和个数基本类似,但两个亚类之间的保守motifs不相同。（3）从TaCLC家族基因分析的7个簇中各挑选一个基因使用荧光定量PCR方法研究Na Cl胁迫和低氮胁迫条件下基因表达变化,除TaCLC-c2簇基因外,该家族基因均可以响应低氮胁迫和Na Cl胁迫而上调表达。低氮胁迫6 h的小麦根部,TaCLC-a-6AS-1基因的表达量最高。Na Cl胁迫后24 h TaCLC-c1-3AS、TaCLC-e-3AL和TaCLC-f2-2DL这3个基因的相对表达量均高于其它基因。（4）构建TaCLCs-p1300-GFP融合蛋白表达载体,使用PEG法转化小麦原生质体,在共聚焦显微镜下观察TaCLC-a-6AS-1、TaCLC-c1-3AS和TaCLC-e-3AL的表达位置,TaCLC-a-6AS-1和TaCLC-c1-3AS这2个基因编码的蛋白在液泡膜上表达,TaCLC-e-3AL编码的蛋白在叶绿体上表达。（5）将酵母重组表达载体TaCLC-a-6AS-1-p416、TaCLC-c1-3AS-p416、TaCLC-e-3AL-p416分别转化酵母突变体菌株YJR040W,该突变体菌株缺失了氯离子通道基因,Cl-或NO3-转运能力受阻,生长受到抑制。转基因酵母菌株在YPD+1 M Na Cl、YPD+1 M KCl、YPD+1 M KNO3固体培养基上均能正常生长,说明这3个基因编码的蛋白具有Cl-和NO3-转运功能。（6）将植物表达重组质粒TaCLC-a-6AS-1-p1300、TaCLC-c1-3AS-p1300、TaCLC-e-3AL-p1300分别转化拟南芥,将过表达株系与WT置于不同NO3-浓度的MS培养基上培养,过表达TaCLC-a-6AS-1和过表达TaCLC-c1-3AS的拟南芥植株在MS培养基和低氮MS培养基上的根长、鲜重均高于WT。MS培养基上生长的过表达TaCLC-a-6AS-1、TaCLC-c1-3AS、TaCLC-e-3AL的拟南芥植株NO3-积累含量均显著高于WT,说明这3个基因具有氮吸收转运功能。（7）采用酵母双杂交技术,筛选出与TaCLC-a-6AS-1、TaCLC-c1-3AS互作的蛋白TaPRK1、TaVDAC1和TaSn RK1.3。通过酵母点对点杂交试验和双荧光素酶互补试验验证蛋白间的互作关系。在酵母点对点验证中,含有BD-Bait质粒和Prey-AD质粒的Y2H酵母能够在SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷培养基上生长。双荧光素酶互补试验中,试验组注射区域存在明显的LUC信号,而其它阴性对照区域则没有检测到荧光信号。说明TaCLC-a-6AS-1、TaCLC-c1-3AS蛋白与TaPRK1、TaVDAC1和TaSn RK1.3蛋白存在互作关系。（8）采用酵母单杂交技术,筛选获得该基因的上游调控转录因子TaWRKY81、TaWRKY96。酵母点对点试验中,含有Bait-p Ab Ai质粒和Prey-AD质粒的Y1H酵母能够在SD/-Leu+Ab A300的抑制缺陷培养基上生长。双荧光素酶报告基因活性检测试验表明,TaWRKY81、TaWRKY96分别能够使TaCLC-a-6AS-1启动子活性上调约2倍和3.5倍。说明转录因子TaWRKY81、TaWRKY96对TaCLC-a-6AS-1存在调控作用。