第一部分、ROS调节大鼠血管中膜干细胞向血管平滑肌细胞分化机制的研究　　研究背景:　　心血管疾病已经成为危胁人类健康的首位疾病。血管疾病常为始发原因，而且缺乏有效的治疗手段。血管平滑肌细胞的生长异常对血管病的形成，发展和疾病预后起重要作用。目前关于血管平滑肌细胞生物学的研究主要集中在正常血管中成熟的收缩型血管平滑肌细胞，然而，血管受到损伤后，另一类型的血管平滑肌细胞，即合成型平滑肌细胞越来越受关注。与收缩型平滑肌细胞相比，合成型平滑肌细胞的特点表现为生长快，分泌多种细胞因子或生长因子从而引起血管损伤。然而，关于合成型平滑肌细胞的来源至今尚未阐明。　　目前，公认的观点是，血管损伤后，合成型平滑肌细胞来源于位于血管中膜的成熟的收缩型平滑肌细胞去分化或表型修饰。另有观点认为合成型平滑肌细胞来自骨髓来源干细胞和血管局部存在的自身干细胞。显然，骨髓来源干细胞对血管损伤的影响主要局限在早期的炎症反应阶段，其分化为合成型平滑肌细胞的概率极低。因而，合成型平滑肌细胞更有可能来源于局部血管壁。也就是说，合成型平滑肌细胞可能来源于收缩型平滑肌细胞去分化或者局部存在的血管自身干细胞，然而，两者的贡献大小尚无文献报道。有趣的是，近期一篇报道引起了广泛关注:血管中膜存在一群(＜10％) SM-MHC(-)干细胞，称为中膜多能血管干细胞(MVSCs)，该细胞通过激活并分化为合成型平滑肌细胞，而不是成熟平滑肌细胞去分化，引起血管病变。尽管未采用条件性平滑肌细胞谱系示踪技术(lineage tracing)来追踪血管平滑肌细胞的最终命运，但是，该研究再次强调了系统研究平滑肌细胞来源的重要性和细胞体内谱系示踪研究对血管病理研究的重要意义。　　研究目的:　　研究大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞来自中膜多能血管干细胞的分化，阐明中膜多能血管干细胞向合成型平滑肌细胞分化的分子机制。　　研究方法:　　1.大鼠中膜多能血管干细胞(MVSCs)培养:采用酶消化法分离和原代培养大鼠中膜多能血管干细胞，分别采用干细胞培养体系和普通培养体系进行培养，传代。　　2.细胞分化实验:采用PDGF-BB诱导，使维持于干细胞培养基中的大鼠中膜多能血管干细胞向平滑肌细胞分化;分别采用相应的诱导因子使大鼠中膜多能血管干细胞向骨，软骨和脂肪分化。　　3.基因干扰:采用RNAi方法，抑制细胞内Pla2g7或NEDD8基因表达。　　4.Real-time RT-PCR:不同条件下获得的细胞使用TRIzol法提取总RNA，采用Real-time RT-PCR检测相应基因mRNA表达水平的变化。　　5.Western blot实验:采用蛋白裂解液裂解不同条件下获得的细胞，BCA试剂盒测定蛋白浓度。获得的蛋白裂解产物用SDS-PAGE胶进行凝胶电泳后检测相应目的蛋白的表达水平。　　6.免疫荧光染色:细胞接种于预先铺细胞爬片的六孔板内培养，行相应刺激后，固定、封闭后先后加入相应一抗和荧光二抗孵育，采用激光共聚焦显微镜或普通荧光显微镜观测相应蛋白在细胞内的表达情况。　　7.流式细胞术:采用流式细胞术检测细胞表面或细胞内相应蛋白的表达。　　8.[3H]胸腺嘧啶掺入法:[3H]胸腺嘧啶掺入法检测细胞的增殖能力。　　9.活性氧(ROS)测定:细胞内ROS水平采用DCHF探针结合后，共聚焦显微镜检测ROS生成，图像采用IPP软件计算。　　10.统计学分析:所有实验重复至少3次，结果采用单因素方差分析或Holmst检验。P＜0.05被认为差异有统计学意义。　　研究结果:　　1.从大鼠胸主动脉新分离培养的中膜多能血管干细胞(MVSCs)表达干细胞相关标志，在传统的培养体系(RGM)而不是在干细胞培养体系(SCGM)中能快速分化为合成型血管平滑肌细胞:　　(1)与培养条件无关，仅有少量新分离的细胞可贴壁存活并生长。与成熟的收缩型平滑肌细胞相比，该细胞的平滑肌细胞相关标志，包括αSMA， SM22α，h1-calponin和smoothelin表达水平极低。　　(2) RGM培养的细胞经历向合成型血管平滑肌细胞的分化，即αSMA，SM22α，h1-calponin和smoothelin表达水平逐渐增高。　　(3) SCGM培养的细胞，其干细胞标志(NFM，Sox10和S100β)的mRNA水平在培养的早期先上调后下降，最终回到基础水平;而RGM培养的细胞，其干细胞标志的mRNA水平与新分离的细胞相比，未发生改变。　　(4)免疫荧光染色的结果显示，几乎所有SCGM培养的P1代细胞均表达干细胞标志NFM，Sox10和S100β。Western blot和流式细胞术结果显示，SCGM和RGM培养的A1代和P1代细胞均高表达干细胞标志NFM，Sox10和S100β，其表达水平在SCGM和RGM培养中逐渐下降，但在RGM培养时下降水平更为显著。　　(5)新分离的细胞表达间充质干细胞的相关标志CD29，CD90和CD44H，其表达水平在RGM培养至第10代未见下降。　　2.SCGM培养的MVSCs细胞具有多能性:　　(1) PDGF-BB显著上调了SCGM培养的P2代MVSCs的αSMA，SM22α，calponin和smoothelin的表达。　　(2)与培养于SCGM的对照组相比，培养于PDGF-BB的细胞，其基质合成相关基因如collagenⅠ，collagenⅢ， elastin以及MMP2/9的表达上调。　　(3)与培养于SCGM的对照组相比，培养于RGM和PDGF-BB的细胞增殖能力更强，与其平滑肌细胞相关标志的表达正相关。　　(4) SCGM培养的P3代MVSCs，分别在相应细胞因子的诱导下，可分化为脂肪细胞，骨或软骨细胞。　　3.内源性活性氧(ROS)在MVSCs向合成型血管平滑肌细胞分化过程中发挥负调控作用:　　(1)与分化的大鼠中动脉平滑肌细胞（RASMCs）相比，MVSCs表达高水平的内源性ROS，在分化为RASMCs过程中，内源性ROS表达逐渐下降。　　(2)在PDGF诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)中，抗氧化基因Nrf2，NQO1，GCLC，GR以及SOD2表达显著上调。以上基因在RGM培养的MVSCs中，其表达水平自P3代开始显著上调并维持到P10代细胞。　　(3)在SCGM培养的P2代MVSCs，加入ROS清除剂Tiron和NAC后，细胞内αSMA，SM22α，calponin和smoothelin表达显著上调。而且，与未加入ROS清除剂的MVSCs相比，诱导的VSMCs增殖能力更强。　　4.脂蛋白相关磷脂酶A2(Phospholipase A2，group7，Pla2g7)通过生成ROS在MVSCs向合成型血管平滑肌细胞分化过程中发挥负调控作用:　　(1)在PDGF诱导的MVSCs向VSMCs分化过程中，Pla2g7的mRNA表达下降。　　(2)抑制Pla2g7基因表达增强了MVSCs向VSMCs分化。　　结论:　　1.新分离的存活的大鼠胸主动脉中膜的细胞是一类中膜多能血管干细胞(MVSCs)，该细胞具有多能性，能快速分化为合成型血管平滑肌细胞。　　2.内源性活性氧(ROS)对维持MVSCs的未分化状态起关键作用，抑制内源性ROS生成启动了MVSC向合成型VSMCs的分化。　　3.Pla2g7通过促进内源性ROS生成，在维持MVSCs的未分化状态中发挥重要作用。　　第二部分、Irisin通过ERK信号通路促进人脐静脉内皮细胞的增殖并部分抑制高糖诱导的凋亡　　研究背景:　　目前研究证实，在威胁人类健康的多种慢性代谢性疾病，如代谢综合征，Ⅱ型糖尿病等，往往伴随内皮细胞的损伤和功能障碍。血管内膜的完整性是血管发挥功能的保障和前提条件，而在许多慢性代谢性疾病中，内皮细胞增殖与凋亡对维持血管内膜的完整性发挥关键作用。基于此，通过调节内皮细胞的增殖和凋亡修复损伤后的内皮细胞，从而修复损伤的血管内膜，使其恢复完整性对许多代谢性疾病引起的血管病的转归具有重要意义。因此，寻找通过促进内皮细胞增殖，减少凋亡的理想靶点对代谢性血管病的治疗是目前研究的热点，但目前的进展仍不理想。　　众所周知，锻炼对代谢性疾病和心血管疾病的预防和治疗具有十分积极的作用。研究证明，Irisin是一种新发现的肌因子，是连接锻炼和代谢平衡的桥梁。当机体锻炼时，Irisin从骨骼肌中的释放出来，可广泛参与机体适度减肥，改善葡萄糖耐受不良等症状。最近的研究发现，血液中Irisin水平在Ⅱ型糖尿病患者及慢性肾病患者中均降低。另有研究证实，Irisin可作为肌肉来源的调节能量消耗的信号，通过促进棕色脂肪产热从而在机体不同组织发挥功能。研究还发现，持续锻炼可促进Irisin表达，从而使BDNF基因表达显著上升。另外，Irisin还可通过调节骨细胞分化在骨代谢中发挥作用。有趣的是，一项新的证据表明，Irisin可通过激活STAT3信号通路促进小鼠H19-7 HN细胞增殖。该研究提示，除了能调节机体代谢平衡，Irisin还具有促增殖的作用。然而，Irisin对人内皮细胞的作用尚未见任何报道。　　研究目的:　　研究Irisin对人内皮细胞增殖和凋亡的影响，并阐明Irisin影响人内皮细胞增殖和凋亡的分子机制。　　研究方法:　　1.培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行实验研究。　　2.人重组Irisin蛋白表达与纯化进行实验研究。　　3.[3H]胸腺嘧啶掺入实验检测Irisin对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。　　4.细胞计数法检测Irisin对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。　　5.免疫荧光染色检测Irisin处理后人脐静脉内皮细胞Ki67的表达。　　6.Western blot检测Irisin处理后人脐静脉内皮细胞信号通路蛋白及凋亡相关蛋白的表达。　　7.流式细胞术检测Irisin处理后人脐静脉内皮细胞的凋亡。　　8.统计学分析:所有实验重复至少3次，结果采用单因素方差分析或Holms t检验。P＜0.05被认为差异有统计学意义。　　研究结果:　　1.Irisin促进HUVEC的增殖:　　(1)[3H]胸腺嘧啶掺入实验结果显示，与对照组相比，无血清条件下20 nM的irisin使HUVEC的[3H]胸腺嘧啶掺入率增加了约2.4倍。　　(2)细胞计数法的结果显示，20nM和40nM的irisin促进了HUVEC的增殖。　　(3) Ki67免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，20nM irisin显著增加了表达Ki67细胞的数量。　　2.Irisin通过激活ERK信号通路促进HUVEC增殖:　　(1) Western blot结果显示，Irisin处理后，HUVEC的磷酸化ERK的蛋白水平升高，而磷酸化p38 MAPK和AKT的蛋白水平未受影响。　　(2) ERK抑制剂U0126抑制Irisin诱导的ERK磷酸化后，Ki67免疫荧光染色和[3H]胸腺嘧啶掺入实验结果显示，ERK抑制剂抑制了对irisin诱导的HUVEC的增殖。　　3.Irisin减少了高糖诱导的HUVEC凋亡:　　流式细胞术结果显示，20nM Irisin有效减少了高糖诱导的HUVEC凋亡。　　4.Irisin下调了Bax，Caspase-9和Caspase-3的表达，上调了抗凋亡蛋白Bel-2表达:　　Western blot结果显示，20nM irisin处理后，Bax，Caspase-9和Caspase-3的表达下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高，GSK-3β与Bad表达未受影响。　　结论:　　1.Irisin促进HUVEC增殖。　　2.Irisin通过激活ERK，而不是p38 MAPK和AKT信号通路，调节HUVEC增殖。　　3.Irisin抑制高糖诱导的HUVEC凋亡。　　4.Irisin通过上调Bcl-2，下调Bax、caspase的表达，抑制高糖诱导的HUVEC凋亡。