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论文对本研究小组鉴定的DPV UL35基因(GenBank登录号EF643558)开展了以下系列研究:DPV UL35基因序列的分子特性分析,DPV UL35基因的克隆、原核表达和抗体制备,在病毒感染宿主鸭胚成纤维细胞中DPV UL35基因表达产物的亚细胞定位检测以及其转录时相和表达时相分析,结果如下:1.鸭瘟病毒UL35基因序列的分子特性分析DPV UL35大小为354bp,编码117aa,包含1个保守结构域,为Herpes_UL35,与小衣壳蛋白家族相关并在Herpes_UL35基因编码蛋白之间高度保守,而且DPV UL35蛋白(VP26)与Genbank上多种α疱疹病毒同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化树分析表明,DPV在分类地位上归属于Alphaherpesvirus亚科,而且有可能属于新的属。另外,亚细胞定位分析表明VP26主要定位于细胞核中,为核靶向蛋白质。密码子偏爱性分析结果显示,编码VP26相同氨基酸的不同密码子使用频率有较大的差异,并且VP26与大肠杆菌、酵母和人的密码子使用偏爱性差异分别有18、19和25个,因此,DPV VP26的密码子偏爱性与原核生物较为接近,与真核生物及人相差较大,其基因表达选择在大肠杆菌等原核系统较为合适。2.鸭瘟病毒UL35基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备对经PCR扩增的UL35基因进行pMD18-T载体克隆,然后通过对pMD18-T-UL35及pEY-32a(+)进行BamHI、HindⅢ双酶切、连接,将UL35基因定向插入pET-32a(+),经BamHI和HindⅢ双酶切以及PCR鉴定表明,成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-UL35,并将其转化入表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,得到大小约为33kDa的重组融合蛋白,与预期表达的蛋白大小相一致。薄层扫描分析表明重组蛋白占菌体总蛋白的32.3%,主要以包涵体的形式存在,最佳表达优化条件为1.0 mmol/L的IPTG在34℃下诱导5h。利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析方法对其进行纯化,获得较高纯度的重组蛋白。将过柱纯化的重组蛋白对家兔进行免疫,制备了兔高免血清,Western-blot检测显示,其能够识别重组表达蛋白,并且琼脂扩散试验效价高达1:32。3.鸭瘟病毒体外感染鸭胚成纤维细胞UL35基因的转录和表达时相分析通过荧光定量PCR对DPV UL35基因在鸭胚成纤维细胞(DEF)的转录时相检测结果表明,随着接毒时间的延长,DPV UL35基因的转录产物呈现先急剧上升,再缓慢下降的趋势。最早在0.5h就已经检测到UL35基因开始转录,随后转录产物量迅速放大,并于感染后12h达到高峰,24h后其相对含量下降到一定水平,但在72h仍保持较高的水平。这种转录谱具有疱疹病毒早期基因的典型特征。以制备的兔抗DPV VP26 IgG为一抗,对感染鸭瘟强毒的DEF进行Western-blot分析,在感染12～72h之间的细胞蛋白提取物中可观察到与DPV VP26蛋白预测大小约13kDa相一致的条带。在感染后12h隐约可见,随着感染时间的延长,从24h起目的条带逐渐变大变清晰,72h达到最大值。综合分析DPV UL35基因的转录表达时相模式,推测该基因为病毒的晚期基因,其在感染晚期得到大量表达,这说明其与病毒的组装与成熟密切相关,但其精确的定义有赖于进一步的研究。4.鸭瘟病毒UL35基因产物在鸭胚成纤维细胞中的亚细胞定位检测通过细胞免疫荧光进行病毒感染DEF的亚细胞定位检测,结果表明:DPV感染DEF后2～8h细胞核内荧光的量相对较少,12～36h逐渐增加,48～72h达到最多,并且在细胞核内的斑点区域聚集呈颗粒状分布;而在细胞质内12h才开始出现少量荧光,24～48h随病毒感染时间的延长而增加,72h的量达到最多。这种分布特征变化可初步推测为DPV基因组编码的VP26在细胞质中完成蛋白质的合成,然后转移至细胞核内并参与衣壳前体的组装,以发挥其基本生物学功能。