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背景：胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是成人最常见，致死性最高的原发性中枢神经系统恶性肿瘤。虽然超过40%以上的GBM患者存在表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)基因扩增或突变，但是EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)在GBM治疗上并未显示出明显的临床效果。GBM患者出现化疗抵抗是导致效果不佳的主要原因之一，但是GBM对EGFR-TKIs产生耐药的潜在机制尚不完全清楚。本研究主要探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白(Leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains， LRIG)2在EGFR-TKIs(吉非替尼)治疗GBM过程中产生耐药所发挥的作用，以期为克服GBM对EGFR-TKIs耐药提供新的治疗策略，从而有望提高GBM患者生存时间。
方法：1、利用CCK8法检测吉非替尼对GBM细胞系U87的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)。2、用含浓度为IC50吉非替尼的培养基培养U87细胞之后，蛋白质免疫印迹(Western Blot)和实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)方法分别检测LRIG2的蛋白和mRNA表达水平。3、利用TCGA和CGGA肿瘤数据库分别分析LRIG2与GAS6，AXL和SRC基因相关性。4、利用免疫组化(IHC)和WesternBlot检测33例胶质瘤标本以及3例正常脑组织标本LRIG2和AXL蛋白水平并分析其中20例GBM中LRIG2与AXL的相关性。5、利用免疫荧光(IF)染色检测GBM标本中LRIG2与AXL表达及定位。6、利用WesternBlot、qRT-PCR和Elisa方法分别检测LRIG2对GAS6/AXL/SRC信号通路调控作用。7、应用免疫共沉淀(Co-IP)、IF和WesternBlot检测LRIG2对AXL的调控机制。8、过表达或干扰LRIG2的U87细胞经吉非替尼(IC50)处理48h之后，CCK8法，PI染色法以及AnnexinV-FITC/PI法分别检测GBM细胞的增殖、周期和凋亡。
结果：1、吉非替尼对U87细胞的IC50为20μM。2、吉非替尼(20μM)处理U87细胞48h后，LRIG2的mRNA表达水平明显升高(P=0.0030)，LRIG2蛋白表达水平也增高。3、在TCGA和CGGA数据库中，LRIG2基因在GBM中分别与GAS6，AXL和SRC成正相关(TCGA中P值分别为：0.0438，0.0002和0.0001；CGGA中P值分别为：0.0087，0.0001和0.0001)。4、免疫组化结果显示LRIG2和AXL在20例GBM标本中的IRS评分成正相关(P=0.0422)；LRIG2与AXL蛋白在GBM中表达水平较正常脑组织(N)和低级别胶质瘤(LGGs)相比，均增高(LRIG2：P值分别为0.0030和0.0370；AXL：P值分别为0.0026和0.0040)，并且两者在20例GBM标本中蛋白表达水平成正相关(P=0.0022)。5、在GBM标本中，发现LRIG2和AXL存在共定位。6、在GBM细胞系中，LRIG2通过促进GAS6的分泌从而活化AXL和SRC。7、LRIG2与AXL结合并抑制其通过蛋白酶体途径降解。8、在U87细胞中，LRIG2增强吉非替尼诱导的AXL活化并重新激活被吉非替尼抑制的SRC。9、吉非替尼治疗后，过表达LRIG2的U87细胞活性较对照组提高(P=0.0260)，细胞凋亡比例较对照组减少(P=0.0035)。干扰LRIG2表达之后，吉非替尼可显著降低U87细胞的活性(P=0.0389)，G0/G1期细胞比例增加(P=0.0078)和S期细胞比例明显降低(P=0.0030)，细胞凋亡的比例明显增加(P=0.0033)。
结论：LRIG2通过调控GAS6/AXL/SRC信号通路促进GBM对吉非替尼产生耐药。靶向LRIG2基因可以提高GBM对吉非替尼的敏感性。
方法：1、利用CCK8法检测吉非替尼对GBM细胞系U87的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)。2、用含浓度为IC50吉非替尼的培养基培养U87细胞之后，蛋白质免疫印迹(Western Blot)和实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)方法分别检测LRIG2的蛋白和mRNA表达水平。3、利用TCGA和CGGA肿瘤数据库分别分析LRIG2与GAS6，AXL和SRC基因相关性。4、利用免疫组化(IHC)和WesternBlot检测33例胶质瘤标本以及3例正常脑组织标本LRIG2和AXL蛋白水平并分析其中20例GBM中LRIG2与AXL的相关性。5、利用免疫荧光(IF)染色检测GBM标本中LRIG2与AXL表达及定位。6、利用WesternBlot、qRT-PCR和Elisa方法分别检测LRIG2对GAS6/AXL/SRC信号通路调控作用。7、应用免疫共沉淀(Co-IP)、IF和WesternBlot检测LRIG2对AXL的调控机制。8、过表达或干扰LRIG2的U87细胞经吉非替尼(IC50)处理48h之后，CCK8法，PI染色法以及AnnexinV-FITC/PI法分别检测GBM细胞的增殖、周期和凋亡。
结果：1、吉非替尼对U87细胞的IC50为20μM。2、吉非替尼(20μM)处理U87细胞48h后，LRIG2的mRNA表达水平明显升高(P=0.0030)，LRIG2蛋白表达水平也增高。3、在TCGA和CGGA数据库中，LRIG2基因在GBM中分别与GAS6，AXL和SRC成正相关(TCGA中P值分别为：0.0438，0.0002和0.0001；CGGA中P值分别为：0.0087，0.0001和0.0001)。4、免疫组化结果显示LRIG2和AXL在20例GBM标本中的IRS评分成正相关(P=0.0422)；LRIG2与AXL蛋白在GBM中表达水平较正常脑组织(N)和低级别胶质瘤(LGGs)相比，均增高(LRIG2：P值分别为0.0030和0.0370；AXL：P值分别为0.0026和0.0040)，并且两者在20例GBM标本中蛋白表达水平成正相关(P=0.0022)。5、在GBM标本中，发现LRIG2和AXL存在共定位。6、在GBM细胞系中，LRIG2通过促进GAS6的分泌从而活化AXL和SRC。7、LRIG2与AXL结合并抑制其通过蛋白酶体途径降解。8、在U87细胞中，LRIG2增强吉非替尼诱导的AXL活化并重新激活被吉非替尼抑制的SRC。9、吉非替尼治疗后，过表达LRIG2的U87细胞活性较对照组提高(P=0.0260)，细胞凋亡比例较对照组减少(P=0.0035)。干扰LRIG2表达之后，吉非替尼可显著降低U87细胞的活性(P=0.0389)，G0/G1期细胞比例增加(P=0.0078)和S期细胞比例明显降低(P=0.0030)，细胞凋亡的比例明显增加(P=0.0033)。
结论：LRIG2通过调控GAS6/AXL/SRC信号通路促进GBM对吉非替尼产生耐药。靶向LRIG2基因可以提高GBM对吉非替尼的敏感性。