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真核细胞mRNA的翻译起始是一个复杂的调控过程,需要很多蛋白的参与,这些蛋白称为真核起始因子(eukaryotic initiation factor),简称eIF。其中,eIF4G是一个支架蛋白,它可以结合eIF4A和eIF4E形成大的复合物eIF4F,参与绝大多数蛋白mRNA的cap-dependent翻译起始过程。eIF4G还可以募集eIF3,然后结合到核糖体的小亚基上。除此之外,eIF4G还可以结合PABP和Mnk1等蛋白,在翻译起始过程中发挥重要作用。
eIF4GⅢ是eIF4G家族的第三个成员,与另两个成员eIF4GⅠ和eIF4GⅡ(统称为eIF4G)不同的是,eIF4GⅢ不参与cap-dependent翻译起始过程,而是在细胞增殖分化或凋亡过程以及细胞受到外界胁迫的情况下,参与IRES(InternationalRibosome-Entry Site)介导的翻译起始过程。
eIF4GⅢ与eIF4G的C端三分之二的结构是高度保守的。由于缺乏eIF4G的N端domain,所以eIF4GⅢ不能跟eIF4E或PABP结合。但是eIF4GⅢ的MIF4Gdomain能跟eIF4A和eIF3发生相互作用,是参与IRES介导的翻译起始中最核心的结构域。
目前已报道human eIF4GⅠ的C端domain、human eIF4GⅡ-M(745-1003)、yeasteIF4G-eIF4A复合物的晶体结构。虽然human eIF4GⅢ的C端domain的晶体结构也有报道,但eIF4GⅢ参与翻译起始的核心部分MIF4G domain仍未见晶体结构发表。本课题的研究目标是解析human eIF4GⅢ的核心结构域MIF4G domain的晶体结构,旨在通过对其晶体结构的分析,找出eIF4GⅢ与eIF4A相互作用的规律,从而为揭示其参与IRES介导的翻译起始的机制奠定基础。
本文完成了human eIF4GⅢ-M(56-333)在E.coli中的表达纯化,筛选并优化了其晶体生长条件,最终获得了分辨率为2.1A的晶体。利用硒代的方法解析了该晶体结构。此晶体结构展示eIF4GⅢ-M(56-333)由10个α-helices组成5个HEAT((H)untingtin,(E)F3,PP2(A),and(T)OR1) repeat domain,每个HEAT repeat相当于一个片层,片层与片层之间通过loop或turn结构相连接,彼此之间通过盐键或疏水作用来稳定自身的结构。通过同源结构比对分析,发现humaneIF4GⅢ-M(56-333)与human eIF4GⅡ以及yeast eIF4G的MIF4G domain结构基本一致,但是在HEAT repeat结构中某些α-helices的长度和空间取向存在一定差异。
本文对human eIF4GⅢ-M(56-333)与eIF4A的复合物结构进行了模拟,并通过实验验证了二者结合力的强弱。本文还对human eIF4GⅢ-M(56-333)与eIF4A复合物晶体生长的条件进行了各种尝试,这些工作为进一步了解eIF4GⅢ与eIF4A相互作用的规律以及eIF4GⅢ调控eIF4A活性的机制打下了良好的基础。