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微管结合蛋白是细胞中最重要的微管动态和组织的调控因子。本论文以拟南芥微管结合蛋白MAP65家族9个成员中氨基酸序列相似性最高的AtMAP65-1和AtMAP65-2为研究对象,从体外生化分析和体内功能鉴定两个角度探讨了它们对微管的作用特点。
本论文首先对AtMAP65-1促进微管聚合的作用方式进行了研究。通过GST Pull-down实验证实了该蛋白可以结合微管蛋白,并且特异性地结合微管蛋白异二聚体中的α-tubulin。浊度法等实验结果证明AtMAP65-1在体外很可能是通过结合微管蛋白来促进微管聚合的。进一步就AtMAP65-1蛋白的各蛋白片段及其促进微管聚合的效应进行了研究。结果显示,AtMAP65-1的蛋白C-端340-587氨基酸片段表现出比全长还要强的促进微管聚合的作用;而蛋白N-端1-339片段则既不结合微管也不结合微管蛋白,且对微管的动态没有影响。进一步实验表明, C-端的495-587氨基酸序列表现出与全长相似的促进微管聚合的效应,当把这一片段删除后,剩下的氨基酸片段1-494虽然可以结合微管,但是不能结合微管蛋白,并且也没有促进微管聚合的效应。以上的研究结果说明,AtMAP65-1氨基酸序列中,495-587片段对该蛋白结合微管蛋白并促进微管聚合起到重要的作用。
很多微管结合蛋白可以在微管间形成横桥结构使微管成束,而微管束在细胞内部有着重要的生理功能。实验室前期研究表明AtMAP65-1能够在微管间形成25-30 nm的横桥,但对微管结合蛋白如何形成这种横桥结构却并不清楚。本论文对这种横桥结构形成的模式进行了研究分析。首先对AtMAP65-1蛋白的三维结构进行了生物信息学的预测分析,结果显示AtMAP65-1氨基酸序列1-494基本上是由螺旋棒状区构成,长度预测显示恰好为25 nm。通过对其相关蛋白结构域的研究,提出了横桥结构形成的模型图:即整个微管间的横桥结构是由两分子AtMAP65-1形成的一个同源二聚体构成,其中一分子的AtMAP65-1的棒状区的N端与另一分子的C端的反向平行结合;而横桥的长度也是由棒状区的长度决定的;AtMAP65-1氨基酸序列中的不规则区(disorderloop)495-587在形成微管间横桥的过程中对丁AtMAP65-1结合微管起到了重要的作用。
在AtMAP65家族中,与AtMAP65-1氨基酸相似性高达78%的AtMAP65-2的功能研究未见报道,二者之间是否存在功能的冗余目前也不清楚。本论文的另一部分工作是对AtMAP65-2的功能以及受磷酸化的调节特点进行了研究。首先克隆该基因并得到体外原核表达的蛋白。体外生化分析结果表明该蛋白不影响微管的聚合动态。体外荧光和电镜观察显示其可以使微管成束,并在微管间形成20-25 nm的横桥结构。低温处理发现AtMAP65-2表现出与AtMAP65-1不同的,可以明显降低微管冷敏感性并稳定微管的作用。瞬时表达结果显示该蛋白在细胞内与周质微管共定位,并且也表现出与体外相似的稳定微管的功能。磷酸化实验部分结果表明该蛋白在体外可以被外源的蛋白激酶CK II磷酸化,而磷酸化后的蛋白对微管成束和稳定作用都有负调控作用。对该基因的植株内的组织学定位研究表明AtMAP65-2主要分布在细胞生长和分裂比较旺盛的部位,如根尖,下胚轴等,推测它可能与细胞的生长、分裂有关。