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研究目的
三阴性乳腺癌(TripleNegativeBreastCancer,TNBC)是乳腺癌的一种特殊亚型,它是指雌激素受体(estrogenreceptor,ER)、孕激素受体(progesteronereceptor,PR)和人表皮生长因子受体-2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER-2)均为阴性表达的乳腺癌.这类乳腺癌虽然仅占所有乳腺癌病理类型的15-20%,但其具有高度异质性,且临床表现为一种侵袭性病程,并与预后不良、远处转移、高复发和高死亡率相关.因TNBC具有以上特殊的临床病理特征和肿瘤生物学行为,临床预后较其他类型差,且尚无理想的治疗方法,已成为乳腺癌研究领域的热点和难点.TNBC缺乏有效的药物作用靶点,目前出现的靶向治疗药物因耐药和治疗反应不足等问题,限制了其临床应用,因此化疗仍是其主要的全身治疗手段,但也存在毒副作用大且易发生耐药等问题,因此寻找有效的TNBC作用靶点,以及高效低毒的候选药物并阐明其作用机制具有重要的临床研究价值.
近年来,天然产物走进了肿瘤领域研究者的视野,因其毒性小、多靶点、不易耐药等优点受到了极大关注.因此,研究天然产物中的有效成分,探究其抗肿瘤的靶点及机制成为目前肿瘤治疗的策略之一.土木香内酯(Alantolactone,ATL),一种天然产物的活性成分,在肿瘤治疗中显示出广谱抗肿瘤活性.有研究显示,ATL能够引起MDA-MB-231细胞产生ROS.硫氧还蛋白(Trx)/硫氧还蛋白还原酶(TrxR)系统参与肿瘤细胞氧化应激的激活并抵抗由氧化应激诱导的细胞凋亡.硫氧还蛋白还原酶1(Thioredoxinreductase1,TrxR1)作为主要的氧化还原调节剂,在多种肿瘤细胞中过表达.因此,我们猜想ATL可能通过TrxR系统产生ROS.然而,ATL在TNBC中的潜在机制和治疗效果在很大程度上仍未知,因此我们拓宽了ATL在TNBC中的抗癌活性研究并探索了新的机制.
研究方法
一、药物作用效果研究:
1.细胞学实验:
通过MTT细胞活性实验对ATL在三种TNBC细胞系(MDA-MB-231,BT-549,MDA-MB-468)中的抗肿瘤效果进行初步评估.通过流式细胞术检测ATL引起的细胞凋亡、周期阻滞,并用蛋白质印记法对相关凋亡和周期蛋白进行验证.我们也研究了ATL对TNBC集落形成的影响.
2.动物学实验:
通过裸鼠异种移植瘤模型研究ATL在体内的抗肿瘤活性.裸鼠皮下接种肿瘤细胞使其成瘤,实验中称量并记录裸鼠的体重及肿瘤大小,腹腔给药治疗.通过对肿瘤体积的测量、并对肿瘤进行蛋白印迹法和免疫组化分析,说明其体内抗肿瘤效果.
二、药物作用机制研究
1.ATL引起ROS积累:
通过流式细胞术检测ATL引起的细胞ROS变化.使用NAC清除ROS后,评估对ATL导致的细胞凋亡和细胞周期阻滞的影响.通过DHE、DCFH-DA探针染色和MDA实验检测裸鼠肿瘤组织的氧化应激和脂质氧化水平.
2.ROS升高引起凋亡相关内质网应激(ER-stress)通路激活:
蛋白印迹法检测ER-stress通路蛋白表达情况,透射电镜直接观察ATL对肿瘤内质网的影响.使用NAC清除ROS后,评估ER-stress的变化.用siRNA沉默ATF4后,流式凋亡实验评估对药物凋亡效果的影响.
3.TrxR1靶点的研究
通过计算机分子模拟对接试验模拟ATL与TrxR1结合的活性位点.TrxR1酶活性实验探究ATL对TrxR1酶活性的影响.通过siRNA沉默TrxR1,评估ATL对细胞ROS和凋亡的影响.检测裸鼠各组肿瘤组织中TrxR1的活性,评估ATL在体内对TrxR1的抑制.
三、临床数据分析
1.通过GEO数据库分析,对比人TNBC组织和其他病理类型肿瘤组织标本中的TrxR1水平.
2.绘制Kaplan-Meier生存分析曲线,评估TrxR1表达量对生存的影响.
3.对20例临床TNBC组织(T)和对应正常乳腺组织(N)进行TrxR1免疫组化染色和TrxR1酶活性检测.
研究结果
在本研究中,我们发现ATL在体内外均具有较好的抗TNBC活性:促进细胞凋亡,引起细胞周期阻滞,影响细胞克隆形成.ATL在体外和体内通过引起ROS积累和随之而来的ROS依赖性内质网应激从而抑制TNBC生长,并且对正常细胞及裸鼠均无明显毒性.我们的临床组织样本分析与公开的TCGA数据库查询结果一致,验证了与正常乳腺组织和其他类型的乳腺癌样本相比,TNBC组织样本中TrxR1表达及其活性显着增加.进一步的分析表明,ATL在体内外均能抑制TNBC的TrxR1活性,并且沉默TNBC细胞中TrxR1的表达后,ATL诱导产生的细胞凋亡和ROS增加.
结论
本论文通过体内外实验及临床标本验证阐明了ATL可通过靶向抑制TrxR1促进ROS-ERstress通路介导的细胞凋亡.我们的研究为土木香内酯有望成为三阴性乳腺癌临床候选药物以及TrxR1作为潜在靶点设计新药提供新的理论依据.
三阴性乳腺癌(TripleNegativeBreastCancer,TNBC)是乳腺癌的一种特殊亚型,它是指雌激素受体(estrogenreceptor,ER)、孕激素受体(progesteronereceptor,PR)和人表皮生长因子受体-2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER-2)均为阴性表达的乳腺癌.这类乳腺癌虽然仅占所有乳腺癌病理类型的15-20%,但其具有高度异质性,且临床表现为一种侵袭性病程,并与预后不良、远处转移、高复发和高死亡率相关.因TNBC具有以上特殊的临床病理特征和肿瘤生物学行为,临床预后较其他类型差,且尚无理想的治疗方法,已成为乳腺癌研究领域的热点和难点.TNBC缺乏有效的药物作用靶点,目前出现的靶向治疗药物因耐药和治疗反应不足等问题,限制了其临床应用,因此化疗仍是其主要的全身治疗手段,但也存在毒副作用大且易发生耐药等问题,因此寻找有效的TNBC作用靶点,以及高效低毒的候选药物并阐明其作用机制具有重要的临床研究价值.
近年来,天然产物走进了肿瘤领域研究者的视野,因其毒性小、多靶点、不易耐药等优点受到了极大关注.因此,研究天然产物中的有效成分,探究其抗肿瘤的靶点及机制成为目前肿瘤治疗的策略之一.土木香内酯(Alantolactone,ATL),一种天然产物的活性成分,在肿瘤治疗中显示出广谱抗肿瘤活性.有研究显示,ATL能够引起MDA-MB-231细胞产生ROS.硫氧还蛋白(Trx)/硫氧还蛋白还原酶(TrxR)系统参与肿瘤细胞氧化应激的激活并抵抗由氧化应激诱导的细胞凋亡.硫氧还蛋白还原酶1(Thioredoxinreductase1,TrxR1)作为主要的氧化还原调节剂,在多种肿瘤细胞中过表达.因此,我们猜想ATL可能通过TrxR系统产生ROS.然而,ATL在TNBC中的潜在机制和治疗效果在很大程度上仍未知,因此我们拓宽了ATL在TNBC中的抗癌活性研究并探索了新的机制.
研究方法
一、药物作用效果研究:
1.细胞学实验:
通过MTT细胞活性实验对ATL在三种TNBC细胞系(MDA-MB-231,BT-549,MDA-MB-468)中的抗肿瘤效果进行初步评估.通过流式细胞术检测ATL引起的细胞凋亡、周期阻滞,并用蛋白质印记法对相关凋亡和周期蛋白进行验证.我们也研究了ATL对TNBC集落形成的影响.
2.动物学实验:
通过裸鼠异种移植瘤模型研究ATL在体内的抗肿瘤活性.裸鼠皮下接种肿瘤细胞使其成瘤,实验中称量并记录裸鼠的体重及肿瘤大小,腹腔给药治疗.通过对肿瘤体积的测量、并对肿瘤进行蛋白印迹法和免疫组化分析,说明其体内抗肿瘤效果.
二、药物作用机制研究
1.ATL引起ROS积累:
通过流式细胞术检测ATL引起的细胞ROS变化.使用NAC清除ROS后,评估对ATL导致的细胞凋亡和细胞周期阻滞的影响.通过DHE、DCFH-DA探针染色和MDA实验检测裸鼠肿瘤组织的氧化应激和脂质氧化水平.
2.ROS升高引起凋亡相关内质网应激(ER-stress)通路激活:
蛋白印迹法检测ER-stress通路蛋白表达情况,透射电镜直接观察ATL对肿瘤内质网的影响.使用NAC清除ROS后,评估ER-stress的变化.用siRNA沉默ATF4后,流式凋亡实验评估对药物凋亡效果的影响.
3.TrxR1靶点的研究
通过计算机分子模拟对接试验模拟ATL与TrxR1结合的活性位点.TrxR1酶活性实验探究ATL对TrxR1酶活性的影响.通过siRNA沉默TrxR1,评估ATL对细胞ROS和凋亡的影响.检测裸鼠各组肿瘤组织中TrxR1的活性,评估ATL在体内对TrxR1的抑制.
三、临床数据分析
1.通过GEO数据库分析,对比人TNBC组织和其他病理类型肿瘤组织标本中的TrxR1水平.
2.绘制Kaplan-Meier生存分析曲线,评估TrxR1表达量对生存的影响.
3.对20例临床TNBC组织(T)和对应正常乳腺组织(N)进行TrxR1免疫组化染色和TrxR1酶活性检测.
研究结果
在本研究中,我们发现ATL在体内外均具有较好的抗TNBC活性:促进细胞凋亡,引起细胞周期阻滞,影响细胞克隆形成.ATL在体外和体内通过引起ROS积累和随之而来的ROS依赖性内质网应激从而抑制TNBC生长,并且对正常细胞及裸鼠均无明显毒性.我们的临床组织样本分析与公开的TCGA数据库查询结果一致,验证了与正常乳腺组织和其他类型的乳腺癌样本相比,TNBC组织样本中TrxR1表达及其活性显着增加.进一步的分析表明,ATL在体内外均能抑制TNBC的TrxR1活性,并且沉默TNBC细胞中TrxR1的表达后,ATL诱导产生的细胞凋亡和ROS增加.
结论
本论文通过体内外实验及临床标本验证阐明了ATL可通过靶向抑制TrxR1促进ROS-ERstress通路介导的细胞凋亡.我们的研究为土木香内酯有望成为三阴性乳腺癌临床候选药物以及TrxR1作为潜在靶点设计新药提供新的理论依据.