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一、背景肝细胞性肝癌(HCC)在肿瘤相关致死性疾病中排第4位,全世界所有肝癌病例中大多数都发生在亚太地区,其中中国肝癌患者的数量逐年增多,占比较大。随着HCC诊治水平不断提高,早期诊断和根治性手术治疗能够明显延长肝癌患者的5年生存率,然而由于HCC容易复发和转移,目前对于晚期肝癌尚未有较好的治疗方法。近年来靶向治疗成为HCC的一项重要治疗手段,尤其在晚期肝癌的治疗中得到了重视,但针对目前多数靶点的靶向治疗效果仍不满意。因此,进一步研究HCC的发病机制,找到肝癌发生发展过程中的关键作用分子,可能为HCC的诊断和治疗提供新的作用靶点与新的思路,具有十分重要的意义。结构型光形态发生信号体9(CSN/COP9)是一种广泛存在于真核生物的高度保守的多蛋白复合体,含有8个亚基,根据其分子量从大到小依次为CSN1-8,不同的亚基功能各不相同。目前在肿瘤领域研究较多的亚基为CSN5和CSN6,它们在许多类型的癌症中表达增高,参与调控蛋白质泛素化降解以维持靶蛋白水平。而其他亚基在肝癌中的作用和相关机制尚不明确。我们通过前期预实验发现CSN1在肝癌细胞系中表达量升高,提示其在HCC的发生发展中可能具有相关功能,需要进一步研究明确。Cyclin A2蛋白是一种高度保守的细胞周期蛋白。Cyclin A2与CDK1和CDK2结合,控制细胞周期的进展,促进细胞有丝分裂,已被认为是癌症诊断和预后的标志物之一。Cyclin A2在HCC中表达增强,参与了HCC的增殖和细胞周期调控,而CSN1是否与cyclin A2存在相互作用,其具体机制如何,仍需要进一步研究。二、研究目的1.明确CSN1在HCC患者组织和人肝癌细胞系中的表达水平。2.通过体内和体外实验研究CSN1对于肝癌细胞增殖、迁移、凋亡和细胞周期方面的影响。3.寻找CSN1的潜在下游作用靶点,初步探索其作用机制。三、材料和方法1.利用TCGA数据库数据进行生物信息学分析,研究CSN1在HCC患者中的表达水平。2.对包含HCC患者癌组织和癌旁组织的组织芯片进行免疫组织化学染色,比较CSN1的表达水平差异,同时结合患者临床病理学数据和随访数据,明确CSN1表达的临床意义。3.通过Western Blotting实验,以人正常肝细胞MIHA为对照,检测人肝癌细胞系MHCC97H、MHCC-LM3、Hep3B中CSN1的表达水平。4.构建特异性干扰CSN1、cyclin A2的si RNA和过表达CSN1的质粒。进行体外细胞实验Ed U实验检测干扰CSN1后对于肝癌细胞增殖能力的影响,通过划痕实验和Transwell实验检测干扰CSN1后对于肝癌细胞迁移能力的影响。流式细胞术研究干扰CSN1后细胞凋亡情况和细胞周期的变化。5.通过异种移植肿瘤实验研究CSN1在体内的生物学作用。6.通过蛋白免疫印迹检测干扰和过表达CSN1后cyclin A2等细胞周期相关蛋白的表达量,找到潜在的下游作用靶点。利用干扰或过表达cyclin A2设计相应表型回复实验,验证cyclin A2是否为CSN1下游靶点。7.利用RT-q PCR实验检测CSN1是否影响cyclin A2的m RNA水平。分别使用Actinomycin D、Cycloheximide阻断细胞转录和翻译,利用泛素化实验检测CSN1是否影响cyclin A2的泛素化降解,利用CHX追踪实验检测上调CSN1是否影响cyclin A2蛋白的半衰期。8.所有统计分析均使用SPSS 20.0(IBM公司)和Graph Pad Prism 8.0(Graph Pad Software,Inc.)进行。所有结果均以均数±标准差表示。采用非配对施图登特t检验分析两组间的差异。采用单因素方差分析和Tukey事后检验分析两组间的差异。采用Wilcoxon符号秩检验和Mann-Whitney’s U检验(未配对数据)分析HCC与邻近组织CSN1表达的差异。生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank检验。p<0.05认为差异有统计学意义。四、结果1.利用TCGA数据库进行生物信息学分析,发现CSN1在肝癌患者中表达量增高。2.肝癌组织芯片免疫组化染色和肝癌细胞Western Blotting实验提示,CSN1表达在肝癌组织和肝癌细胞中显著增高。临床数据分析提示CSN1表达量与患者的年龄、性别、乙肝感染、AFP等无相关性,而与肿瘤大小、淋巴结转移、肝内转移、血管侵犯、肿瘤分期相关。高表达的CSN1与更低的生存率(17.38%vs 37.78%,p=0.0285)、更低的无瘤生存期(11.30%vs 25.74%,p=0.0281)相关。3.Ed U实验提示干扰CSN1后肝癌细胞增殖能力显著降低;划痕实验、Transwell实验结果提示,干扰CSN1后肝癌细胞迁移能力显著降低。流式细胞术结果提示干扰CSN1后肝癌细胞凋亡率显著增加;G1期细胞比例显著增加,S期和G2/M期细胞比例显著下降。异种移植肿瘤实验证实体内CSN1过表达可以促进肿瘤生长。4.过表达CSN1后cyclin A2的表达量增加,干扰CSN1后cyclin A2的表达量降低。表型回复实验证实,干扰cyclin A2可以逆转过表达CSN1对细胞增殖、迁移的促进作用。5.Cyclin A2的m RNA水平与CSN1正相关;CSN1不影响cyclin A2的泛素化水平和蛋白半衰期;环己酰亚胺阻断实验证实过表达CSN1后不影响cyclin A2的降解,转录翻译抑制实验证明CSN1在转录水平影响cyclin A2的合成。五、结论CSN1在HCC组织和细胞系中表达显著升高,CSN1的高表达与患者更高的恶性程度和更差的预后相关。干扰CSN1可显著抑制肝癌细胞的增殖和迁移,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。体内过表达CSN1可以促进肿瘤生长。机制上,Cyclin A 2是CSN1的下游效应分子之一,CSN1可以通过在转录水平促进cyclin A2的表达来调控肝癌细胞的增殖和迁移。综上,CSN1可能成为一种潜在的HCC治疗新靶点。