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近年来,心脑血管疾病已成为人类健康的头号杀手。其中动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是导致冠心病、脑卒中等疾病的关键病理环节。研究表明,AS的发展进程与单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1）息息相关。在动脉粥样硬化形成的早期,受MCP-1的调控,单核细胞迁入动脉内膜转变为巨噬细胞。巨噬细胞黏附于血管内皮细胞,并迁入内皮下摄取脂质转化为泡沫细胞,进而形成斑块。斑块内大量巨噬细胞聚集是炎症活跃的主要标志。因此,通过抑制MCP-1分泌从而抑制单核细胞的迁移、浸润有望成为早期治疗动脉粥样硬化的有效策略。宾达利（Bindarit,BIN）被证实是一种有效的MCP-1/CCL2（CC类趋化因子配体2,Chemokine CC motif ligand 2）的选择性口服抑制剂,但其依然存在口服制剂的缺点,即:非特异性分布导致的病灶处药物滞留率低,需要长时间、大剂量给药。因此,如何通过口服实现宾达利的靶向递送至动脉粥样硬化斑块部位以降低给药剂量同时提高病灶药物滞留浓度是我们研究的核心问题。通过本课题组前期研究结果表明,利用仿生途径,去除内容物的酵母微囊（Yeast Capsules,YCs）可以通过口服途径靶向至肿瘤及急性炎症部位。因此本课题中,通过相似原理,模仿细菌通过肠道侵染机体途径,利用酵母微囊作为载体,构建口服宾达利靶向递送系统用于治疗动脉粥样硬化。方法:1.YCs的制备取一定量酵母,经酸碱处理后用异丙醇清洗两次,而后干燥,得到空白酵母微囊。2.BIN/PEI的制备及表征称取一定量的宾达利和聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine,PEI）共溶于二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide,DMSO）中,转移至透析袋中,纯水中透析8 h,即可得到宾达利/聚乙烯亚胺（BIN/PEI）纳米粒。表面电位粒度仪测定其粒径大小及表面电位,透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy,TEM）观察纳米粒形态。3.BIN/YCs的制备及表征在一定量的YCs中,加入BIN/PEI NPs,其中BIN/PEI的质量比为1:1。将二者混匀,YC与BIN/PEI的质量比为1:1,后37℃孵育3 h。冻干后即得到酵母微囊负载宾达利的纳米粒（BIN/YCs）,利用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）测定其载药量,运用透射电子显微镜及激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM）观察纳米粒在酵母微囊内部的包埋情况。4.BIN/YCs的体外释放评价配制p H 7.4的磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline,PBS）,将载药酵母微囊混匀至PBS中,分别于9个时间点（1 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h、24 h、36 h、48 h）取上清液。使用HPLC测定BIN的释放量,并计算其累积释放百分率。5.口服酵母微囊对AS斑块的靶向作用研究通过化学反应将荧光花青染料5.5（Cyanine 5.5,Cy5.5）化学键合至PEI,纯水中避光透析制备得到Cy5.5-PEI。重复上述BIN和PEI的组装步骤,获得BIN/PEI-Cy5.5NPs。然后将YC与BIN/PEI-Cy5.5 NPs共孵育得到荧光标记的酵母微囊（BIN-Cy5.5/YCs）。采用载脂蛋白E缺陷小鼠(apolipoprotein E,Apo E-/-)给予高脂饮食建立动脉粥样硬化模型,连续4天分别口服灌胃给予BIN/Cy5.5-PEI NPs和BIN-Cy5.5/YCs,于第5天对小鼠实施安乐死后剥离其主动脉及各主要脏器组织,通过活体成像观察并统计荧光强度。6.口服载药酵母微囊治疗AS的药效学评价用Apo E-/-小鼠建立AS模型,分别给予生理盐水、BIN、BIN/PEI NPs及BIN/YCs,每三天一次灌胃治疗,治疗1个月后,剖离其他主要脏器并取主动脉,用油红O染色进而评价斑块的发展情况。采用免疫组化染色法通过CLSM观察小鼠主动脉根部切片斑块分布情况。运用流式细胞术测定小鼠全血内单核巨噬细胞比例。7.口服载药酵母微囊治疗动脉粥样硬化的初步安全性研究取全血测定血常规,取血清测定血脂水平,取各脏器及胃肠道组织,做常规病理切片,经苏木素-伊红染色后,观察各组小鼠脏器及胃肠道组织结构的病理性改变。结果:基于酵母菌酸碱处理后成功获得外壁主要由β-1,3-D-葡聚糖构成的酵母微囊。并利用正电荷纳米粒与酵母微囊间的静电作用,通过聚集在酵母微囊表面,后进入酵母微囊内部形成BIN/YCs。经过聚乙烯亚胺与宾达利原料药组装形成纳米粒,粒度分析仪与电位分析仪结果显示纳米粒粒径为25.24±2.62 nm,Zeta电位为34.70±0.30 m V。利用静电介导的自发沉积,通过简单的混悬过程,将BIN/PEI正电荷的纳米粒成功负载于YC中,TEM观察结果显示,纳米粒均匀分散于酵母微囊的内部。其平均粒径为3451.45±443.45 nm,Zeta电位为0.01±0.02 m V。正电荷宾达利纳米粒及酵母负载宾达利纳米粒在p H 7.4条件下,药物8 h内完全释放。活体成像结果显示,经口服给药BIN-Cy5.5/YCs后,可显著提高Cy5.5在动脉粥样硬化斑块部位的聚集。分析各脏器组织荧光强度可以发现,在淋巴相关的肠系膜淋巴结、小肠及主动脉斑块部位的荧光强度均有显著增加。油红O染色结果表明,口服给药BIN/YCs后Apo E-/-小鼠的AS斑块比例显著降低,血清中相关促炎因子水平显著降低。初步安全性评价表明血液生理指标、肝肾功能均无显著性差异,脏器组织无明显病理性改变。结论:利用静电吸附作用,正电荷的宾达利纳米粒可以成功负载于YC内部。口服给药后,BIN/YCs可以靶向至小鼠动脉粥样硬化斑块部位,此过程与淋巴系统及肠道组织密切相关。同时单核巨噬细胞在靶向过程中可能发挥重要作用。口服BIN/YCs能够有效降低AS斑块的生长,且未出现明显的毒副作用。综上所述,本课题通过构建口服靶向制剂至炎症部位,以酵母微囊作为药物载体,构建了用于AS防治的口服靶向BIN递送系统,有望为开发成一种新型AS治疗药物提供了理论和实验依据。