论文部分内容阅读
研究目的:本研究旨在探讨传统中药丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)中的活性成分丹酚酸A(Salvianolic acid A,SA)对脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的小鼠急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)的改善作用及相关作用机制。研究方法:动物实验:将32只雄性BALB/C小鼠(18±22g)随机分为4组,每组8只。空白对照组、LPS刺激的模型组、丹酚酸A+LPS治疗组、地塞米松(DEX)+LPS阳性对照组。造模前,通过灌胃给药的方式,预给药丹酚酸A+LPS治疗组丹酚酸A(60 mg/kg)1小时,阳性对照组通过腹腔注射方式给予地塞米松(5 mg/kg)1小时后,除空白对照组以外,其余组腹腔注射LPS(10 mg/mL)刺激18小时,18小时后用10%水合氯醛麻醉小鼠,集中处死。将小鼠肾脏石蜡包埋、切片后,苏木素-伊红(H&E)染色观察肾小管损伤情况;免疫组化法观察巨噬细胞在身损伤部位的聚集情况;血浆肌酐(Serum creatinine,Scr)和血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)试剂盒检测Scr和BUN水平的变化;酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠血清中促炎因子肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factorα,TNF-α)和小鼠白介素-6(Interleukin-6,IL-6)释放水平。细胞实验:通过体外培养巨噬细胞系RAW264.7,用MTT法筛选出丹酚酸A最适给药浓度。将细胞分为空白对照组、LPS刺激的模型组、丹酚酸A+LPS治疗组、丹酚酸A单独给药组。造模前,分别给予丹酚酸A+LPS治疗组和丹酚酸A单独给药组丹酚酸A(10μM)1小时,LPS(1μg/mL)刺激18小时后,检测细胞上清液中TNF-α及IL-6释放水平;通过免疫印迹法(Western blot)检测炎症介质环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、炎症相关信号通路Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)、髓样分化因子(Medullary differentiation factor,MyD88)、内质网应激相关蛋白p-PERK、CHOP、p-elF2α、elF2α以及丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的蛋白表达情况;此外,通过流式细胞仪检测一氧化氮(Nitric oxide,NO)、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的释放情况及细胞内Ca2+的释放情况,并通过免疫荧光法检测NF-κB/p65细胞核定位情况;计算机辅助模拟实验进一步观察丹酚酸A和LPS与TLR4结合位点的关系。结果:体内动物实验中,在LPS诱导的急性肾损伤小鼠模型中,采用H&E染色法观察肾脏组织学的形态变化以及肾小管损伤情况。与正常对照组肾小管相比,模型组肾小球明显萎缩、空泡化。与预期一样,丹酚酸A和DEX均可显著减轻LPS诱导的模型小鼠肾脏损伤。用血浆肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)试剂盒测定肾功能情况,结果与H&E染色法一致,丹酚酸A和DEX组均明显降低了Scr和BUN水平(p<0.01)。此外,丹酚酸A可显著抑制肾损伤小鼠血清中的炎性细胞因子TNF-α和IL-6的释放(p<0.01)。免疫组化的结果显示,急性肾损伤组肾脏组织中F4/80阳性巨噬细胞的聚集明显增多,而丹酚酸A和DEX均减少了F4/80阳性巨噬细胞浸润。总之,丹酚酸A通过抑制肾小球萎缩、降低Scr和BUN水平,显著改善LPS诱导的肾损伤。同时,丹酚酸A能显著降低血清炎性细胞因子的释放,阻断巨噬细胞在受损肾组织中的炎性浸润,提示丹酚酸A通过炕沿机制来改善肾损伤。体外实验研究中,通过MTT法检测丹酚酸A对巨噬细胞的最适给药浓度,根据MTT筛选结果,丹酚酸A的浓度在10μM时没有细胞毒性可以用于后续实验。在后续的研究中,通过Griess试剂盒以及NO流式荧光探针DAF-FM检测亚硝酸盐的生成情况,结果表明LPS刺激巨噬细胞RAW264.7中的NO的大量释放,而丹酚酸A给药组能够明显抑制LPS诱导NO的释放。Western blot结果表明,丹酚酸A能够显著抑制LPS诱导的巨噬细胞中COX-2以及i NOS的表达(p<0.01),同时能够抑制LPS诱导的巨噬细胞上清液中促炎症因子TNF-α和IL-6的释放,这与体内实验的结果一致。Western blot结果显示,在RAW 264.7细胞中,丹酚酸A能显著抑制LPS激活的TLR4/MyD88通路的蛋白表达(p<0.01)。此外,沉默TLR4能够显著降低炎症因子TNF-α和IL-6的释放,这提示TLR4在炎症过程中的调节作用。内质网应激与许多急性疾病相关,在目前的研究中,Ca2+过载,PERK-EIF2α-CHOP通路与LPS诱导的内质网应激反应相关,而丹酚酸A预处理能够逆转这些现象。此外,氧化应激也参与急性肾损伤的发生发展过程,而丹酚酸A和ROS清除剂NAC均能减少LPS诱导的ROS生成。此外,Ca2+螯合剂BAPTA-AM和活性氧清除剂NAC都能抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的释放。LPS能够激活巨噬细胞MAPK通路,丹酚酸A对JNK1/2的磷酸化有明显抑制作用(p<0.01),但对ERK1/2和p38MAPK无明显影响。免疫荧光结果显示,丹酚酸A可显著抑制LPS诱导的NF-κB/p65向细胞核的转位。计算机辅助模拟实验表明,丹酚酸A和TLR4结合位点与LPS发生竞争性抑制,从而抑制LPS诱导的炎症信号通路TLR4的激活,抑制炎症的发生。结论及意义:基于以上研究背景,丹酚酸A可能对炎症性急性肾损伤具有潜在的治疗作用。综上所述,丹酚酸A可作为抑制炎症反应预防急性肾损伤的潜在治疗药物,能够为临床治疗急性肾损伤提供一定的理论依据和潜在治疗药物。