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金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)多年生附生草本植物,药用历史悠久,早在《神农本草经》中就有关于药用方面的记载。作为石斛的主要品种之一,金钗石斛是历版《中华人民共和国药典》收载种。除药用外,金钗石斛还具有较高的观赏价值。金钗石斛药材主要来源于野生资源,近年来由于药用需求日益增大,野生金钗石斛被过度采挖,原生态环境也遭到严重破坏,导致野生居群规模锐减,我国已将其列为重点保护物种。最近几年,云南、四川与贵州等地陆续对金钗石斛进行了人工栽培,在一定程度上缓解了野生资源压力,但是不同地理分布与栽培的金钗石斛在遗传结构及品质上是否存在差异尚未引起足够的重视,而这些问题的阐明对于金钗石斛优良种质的选育具有重要的意义。
本文应用ISSR(Inter-simple Sequence Repeat)分子标记研究了金钗石斛居群的遗传多样性。通过对ISSR反应过程中的一些重要参数进行考察,建立了适合于金钗石斛遗传多样性研究的稳定的反应体系。选取21个金钗石斛居群152个个体,用筛选出的10条ISSR引物进行PCR(polymerase chain reaction)扩增,共扩增出292条重复性高、清晰的条带,扩增片段的长度为100～3000 bp,多态性条带为292条,多态百分率(P)为100％。在物种水平,等位基因数(Na)是2.0000,有效等位基因数(Ne)是1.3863,期望杂合度(He)是0.2398,香农信息指数(Im)为0.3783;在居群水平,多态百分率为9.93％～47.95％,期望杂合度为0.0740～0.1674,香农信息指数为0.0601～0.2519,表明金钗石斛具有丰富的遗传多样性,而且居群间的差异明显,但是栽培居群的遗传多样性不比野生居群的低,说明金钗石斛在栽培过程中遗传多样性基本上没有丧失,可在遗传多样性较高的云南地区进行大面积的人工栽培,以栽培品替代野生品作药用,缓解资源紧缺的状况。
遗传结构分析表明,在物种水平,较小的基因流(0.3651)导致了居群的分化,居群间的遗传变异(Gst=0.5779)略高于居群内。POPGEN分析显示,21个居群遗传一致性为0.7149～0.9527,平均为0.8506。遗传距离聚类分析表明,遗传距离与地理分布有一定的相关性,广西的2个居群,贵州的2个居群都分别聚在一起,四川的5个居群也聚在同一分支。实验结果还显示,用ISSR标记可以建立不同产地金钗石斛具有一定鉴别意义的DNA指纹图谱,其中筛选出的8条ISSR引物能够将分布于云南、贵州、广西、重庆与浙江的金钗石斛鉴别出来。
为了对金钗石斛的质量进行评价,对其特征性成分生物碱进行了分离,从金钗石斛茎中分离出石斛碱、石斛醚碱、4-羟基石斛醚碱等6个生物碱类成分。对20个产地的金钗石斛药材用薄层扫描法进行了定量分析,结果显示,石斛碱在1.2～7.2μg(r=0.9971)范围内呈良好的线性相关,各产地中3个野生居群的石斛碱含量明显高于栽培居群,海南昌江霸王岭居群的石斛碱含量最高,说明此地也比较适合栽培金钗石斛。在此基础上,应用Mantel统计检验探讨了石斛碱含量与遗传距离的相关性,发现金钗石斛的遗传多样性与石斛碱含量变化无明显相关。
金钗石斛野生与栽培居群的遗传多样性水平高,其遗传变异在居群间与居群内的分布差异不大,野生居群的石斛碱含量普遍较高,因此不但要保护金钗石斛的野生栖息地,同时也应充分重视居群内个体的保存,以防止在栽培过程中金钗石斛遗传多样性的丢失。