【摘 要】
：
氧化还原酶是一类重要的生物催化剂,同时作为辅酶再生酶,广泛应用于多种重要的生物催化反应过程,常用的酶包括葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶等。其中谷氨酸脱氢酶（GDH）可催化谷氨酸合成α-酮戊二酸及其可逆反应,过程中伴随着NAD（P）+及NAD（P）H的再生。本论文对GDH表面电荷及稳定性进行了改造,以便进一步提高其在氧化还原反应中的使用效率,主要结论如下:（1）在大肠杆菌中过量表达了八种不同
论文部分内容阅读
氧化还原酶是一类重要的生物催化剂,同时作为辅酶再生酶,广泛应用于多种重要的生物催化反应过程,常用的酶包括葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶等。其中谷氨酸脱氢酶（GDH）可催化谷氨酸合成α-酮戊二酸及其可逆反应,过程中伴随着NAD（P）+及NAD（P）H的再生。本论文对GDH表面电荷及稳定性进行了改造,以便进一步提高其在氧化还原反应中的使用效率,主要结论如下:（1）在大肠杆菌中过量表达了八种不同来源的GDH,经过酶活及酶学性质比较,将筛选到酶活较高的Bacillus subtilis 168来源的NADH依赖型BsGDH为研究对象,随后对BsGDH进行酶学性质分析,发现BsGDH具有氧化还原双方向酶活性,其最适催化pH均为弱碱性（分别为pH 8.0和pH 7.5）,但在弱碱环境下该酶稳定性较差,该酶在pH 8.0条件下放置35 h后仅剩46%的酶活力,pH 8.5条件下放置半小时就会完全失活;最适催化温度分别为60℃和65℃,该酶热稳定性较差,大于55℃的条件下放置2 h,氧化方向的酶活就会完全丧失,还原方向也仅能保留14%的残留酶活。（2）为了提高BsGDH在氧化还原反应中的经济性,首先基于蛋白表面电荷工程,对该酶进行分子改造,以期将其催化最适pH调至其稳定性较高的中性环境。利用ROSETTA软件选择8个突变候选位点,结果发现突变体N16D、K218D和M277D催化最适pH由8.0下调至7.0,同时酶活较野生型分别提高了2.9倍、5.4倍和3.9倍,但其组合突变体的酶活完全丧失。另外,将BsGDH与其它8种嗜热来源的GDH进行氨基酸序列比对得到突变位点,获到热稳定性明显提高的突变体BsGDHE27F+S70V+S305E,在50℃放置16 h后依然剩余48%的酶活,而野生型放置3 h就完全失活。（3）对BsGDH作为主酶催化合成α-酮戊二酸进行了初步探究。首先考察了辅酶浓度对BsGDH催化的影响,发现辅酶NAD+/NADH浓度越大,其反应速度越快。为了降低辅酶NAD+/NADH添加量,我们利用B.subtilis 168来源的NADH氧化酶（BsNOX）和BsGDH构成辅酶NAD+/NADH耦合循环再生体系,与BsGDH的单酶转化相比,在此耦合体系中,BsGDH生成α-酮戊二酸的反应速率提高了30%。根据先前BsNOX酶学性质分析,BsNOX最适催化pH为9.0,为调整其最适pH,我们通过ROSETTA软件相同的方法设计得到了16个突变位点,筛选得到了最适pH降为7.0,且酶活提高2.9倍的突变体BsNOXN20D+N116E,在组合BsGDHK218D+BsNOXN20D+N116E体系中反应45 min就可以达到90%左右的转化率。（4）探究了BsGDH在辅酶NAD+/NADH循环再生中的应用前景,首先构建了BsGDH与B.cereus来源的亮氨酸脱氢酶（BcLDH）偶联催化体系,发现偶联体系中产量更高、转化速度更快,其中BsGDHK218D-BcLDH体系则可得到60.47 g·L-1 L-苯甘氨酸,而BcLDH的单酶转化体系中,仅产生10.8 g·L-1 L-苯甘氨酸,说明BsGDH及其突变体可以有效应用于NADH的循环再生;另外,构建了BsGDH与B.subtilis 168来源的乙偶姻还原酶（BsAR/BDH）的偶联催化体系。BsAR/BDH单酶转化体系中,仅有14.53 g·L-1乙偶姻生成,而在BsGDHE27F+S70V+I331P-BsAR/BDH偶联体系中反应速率加快并且生成30.93 g·L-1的乙偶姻,说明BsGDH可以有效应用于NAD+的循环再生。
其他文献
食药用真菌超支化多糖不仅具有水溶性好、分散性高、粘度低、末端羟基多便于功能化改性等特点,还具有降血糖、降血脂、抗氧化、增强人体免疫能力等多种生物活性,因而受到广泛关注。虎奶菇超支化β-葡聚糖（PTR-HBG）是一类具有高度支化结构的天然葡聚糖,分支度最高可达70%。虽然高分支结构具有各种优良的性质,但过高的分支度也限制了其构效关系的研究和进一步的开发应用。针对这些问题,本研究以PTR-HBG为研究
微生物脂肪酶具有良好的底物选择性、不需辅因子、绿色环保等优点,已被广泛应用于食品、医药、洗涤剂等多种行业中。无论实际应用的工艺条件如何,热稳定性都是脂肪酶最受关注的特性之一。然而,当前的研究大多集中于中温脂肪酶,其耐热性能较差,难以满足大规模工业应用的要求。微生物嗜热脂肪酶却能很好地满足这一要求。本实验室前期已对一种来源于Thermomicrobium roseum DSM 5159的嗜热脂肪酶（
针对酶热稳定性的改造一直是蛋白质工程中研究的热点之一。传统的蛋白质工程如定向进化往往以低筛选效率为代价得到符合工业需求的变体。近年来,基于计算机辅助的多种计算设计策略的发展为酶的热稳定性改造提供了更多的思路。本文中以来自奇异变形杆菌的脂肪酶（Proteus mirabilis lipase,PML）作为模式蛋白,基于其结构信息和序列信息,利用两种不同多重计算策略提高其热稳定性,以期进一步拓展其在工
疫苗作为一种生物产品,在疾病的预防和治疗方面发挥了无法取代的关键性作用。佐剂的加入在疫苗中发挥了重要作用,不仅有助于增强疫苗稳定性,还能增强疫苗的有效性。铝佐剂是我国在疫苗中唯一批准使用的佐剂,在增强体液免疫方面获得广泛验证,但铝佐剂也具有技术壁垒,即难以激活有效的细胞免疫反应。因此,如何基于铝佐剂进一步设计稳定、安全、高效的疫苗佐剂,对疫苗新佐剂的快速构建和临床转化具重要意义。以已批准的铝佐剂为
本研究的目的是评估细胞表面展示技术在热带假丝酵母中的潜在应用,以热带假丝酵母为宿主细胞,利用外源展示蛋白基因构建新型酵母表面展示系统,将外源β-葡萄糖苷酶以及α-淀粉酶基因高效展示表达在酵母表面,验证系统的可行性。主要内容包括:（1）利用NCBI获得来源于酿酒酵母的5种锚定蛋白SED1、AGα1、EGT2、CWP2、DAN4的序列。构建五种不同锚定蛋白展示ye GFP的重组菌株,通过激光共聚焦显微
动物细胞大规模培养是以收获生物制品为目的,在大型生物反应器中模拟体内环境进行动物细胞培养的技术,其在人类社会中的作用日益凸显。猪肌干细胞作为人造肉最有潜力的种子细胞,必须达到较大的数量才能满足人类的需求。气升式反应器由于结构简单、成本低廉以及剪切力分布均匀,20世纪80年代曾被认为是大规模动物细胞培养的最佳选择,但随后气泡破裂产生的剪切力给细胞带来的损伤,使气升式反应器用于大规模动物细胞培养的研究
N-端编码序列（N-terminal coding sequence,NCS）通常指从起始密码子后开始、长度为30～96 nt的编码序列,其能从翻译水平调控基因表达强度。通过改造目的基因的N-端编码序列,能够实现对基因表达水平的调控。这种调控策略具有分子操作简便、调控效果显著等优势,并且能与启动子等其他基因表达调控元件协同作用,实现基因表达的精细调控。然而,由于NCS调控机制复杂、难以进行理性的人
偏头痛是一种致残性神经系统疾病，可依据临床标准进行诊断。这些诊断标准并没有完全体现偏头痛的异质性，包括其潜在的遗传学和神经生物学因素，因此推动了生物标志物的研究来阐明疾病特征以及识别新的药物靶点。该文介绍了在遗传学、疾病诱发模型、生物化学和神经影像学领域中偏头痛生物标志物的研究进展。此外，概述了每种生物标志物体系所面临的挑战和未来研究方向，并讨论整合生物标志物体系研究中取得的进展，将有助于偏头痛精
蔗糖磷酸化酶（Sucrose phosphorylase,SPase）是糖苷水解酶13家族中的一类,可以催化蔗糖发生可逆的磷酸解反应。基于其广泛的底物混杂性,葡萄糖基团可以被SPase转移至甘油、D-葡萄糖和D-半乳糖上,所合成的产物2-O-α-D-甘油葡萄糖苷（2-O-α-D-Glucosylglycerol,αGG）、曲二糖及蜜二糖,在食品、医药及化妆品中具有广泛的应用。利用SPase催化产生
嗜酸喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）作为生物浸出过程的典型优势菌株,在生物浸出过程中发挥重要作用。在铜矿资源的生物浸出后期,体系中存在大量的Cu2+,浸矿微生物能够耐受较高浓度的Cu2+是发挥其浸出作用的重要前提。前期课题组获得铜离子耐受较强的A.caldus,研究表明在极端的铜离子胁迫下,A.caldus会产生胞外聚合物（EPS）,EPS已被证明可通过与重金属离子结