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第一部分apo M单克隆抗体的制备目的:制备高亲和力、高纯度的小鼠抗人apo M的单克隆抗体。方法:选取6~8周龄、雌性BALB/c小鼠,每只小鼠以弗氏佐剂加apo M重组蛋白50mg/只进行初次免疫,每隔15天免疫1次,共免疫6次。于融合前4~5天,再次以弗氏不完全佐剂加apo M重组蛋白50mg/只加强免疫。选取检测阳性的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合及选择性培养。筛选阳性杂交瘤细胞并进行克隆化培养,直至抗体分泌阳性率大于95%。利用小鼠腹腔接种法获得含大量特异性抗体的腹水,经Protein G柱纯化,对抗体进行定量及特异性检测。结果:经筛选、融合、选择性培养及亚克隆,成功获得4株持续分泌特异性鼠抗人apo M单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Western检测结果显示,在约25k D处4株单抗均有特异性条带,与apo M重组蛋白的分子大小位置符合。进而选择克隆号为1368CT871.72的杂交瘤,采用腹水诱生方案进行抗体的大量表达。腹水经protein G柱纯化后,apo M单抗蛋白含量为1mg/ml。Western blot检测结果显示,纯化后的apo M单抗经梯度稀释后,在1:4000仍能检测出目的蛋白。结论:制备的小鼠抗人apo M单克隆抗体具有很好的灵敏度和特异性。第二部分apo M+HDL的分离纯化及其与SR-BI结合能力检测目的:分离HDL组分中apo M+HDL和apo M-HDL颗粒,检测apo M+HDL和apo M-HDL颗粒在体外与SR-BI的结合能力。方法:小鼠抗人apo M单克隆抗体通过共价结合方式不可逆的与Hi TrapNHS-activated HP 1 ml预装柱结合,通过亲和层析的方法,将HDL蛋白中apo M+HDL和apo M-HDL两个组分分离,进而采用BCA蛋白定量方法对分离的蛋白进行定量分析。选取人单核细胞株THP-1细胞经体外PMA、ox-LDL诱导,再经apo M–HDL、apo M+HDL、重组人apo M蛋白于37℃培养箱中分别孵育6 h,收集细胞并提取总蛋白,用抗SR-BI的单克隆抗体沉淀蛋白复合物后进行Western blot检测。通过免疫共沉淀方法检测apo M+HDL、apo M-HDL和重组apo M蛋白在THP-1细胞表面与SR-BI的相互作用。结果:人高密度脂蛋白HDL经Hi Trap NHS-activated HP柱子纯化,分别收集流出液(apo M–HDL)、洗脱液(apo M+HDL),apo M抗体进行Dot blot及western检测,结果显示,在未经纯化的HDL蛋白、纯化后第一、二、三管洗脱液中均能检测到apo M蛋白,流出液(apo M–HDL)组分中未检测到apo M蛋白。apo M–HDL、apo M+HDL蛋白经透析后定量,终浓度分别为3.23 mg/ml和0.34 mg/ml,总体积为6.2ml和3.5ml。PMA处理THP-1细胞,其表面SR-BI的表达会有升高约10%左右,免疫共沉淀结果显示,apo M–HDL、apo M+HDL孵育组的总蛋白经SR-BI抗体沉淀复合物中均能检测到SR-BI和HDL蛋白,重组人apo M孵育组的总蛋白经SR-BI抗体沉淀复合物中也能检测到SR-BI和apo M蛋白。结论:经HDL蛋白成功分离apo M–HDL和apo M+HDL两种蛋白成分。证实THP-1细胞表面apo M–HDL、apo M+HDL和重组人apo M与SR-BI蛋白之间存在相互作用。第三部分apoM+HDL对巨噬细胞炎症因子表达的影响及可能的作用机制目的:拟利用体外诱导人单核细胞株THP-1分化为巨噬细胞,进而构建体外泡沫细胞模型。分别利用apo M+HDL和apo M-HDL蛋白进行刺激,luminex 200分析apo M+HDL和apo M-HDL对炎症因子的影响,并结合全基因组芯片扫描分析可能的作用机制。方法:(1)以PMA诱导人THP-1细胞株分化为巨噬细胞,经ox-LDL负载24hr,经油红O染色观察细胞内脂质情况。(2)apo M+HDL和apo M-HDL蛋白分别刺激诱导后的THP-1 24hr,取细胞上清液,利用luminex技术检测TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β、MCP-1的表达情况。(3)收集上述处理的细胞,抽提m RNA,利用人基因表达谱芯片(Gene Chip®Prime View?Human Gene Expression Array)分析apo M+HDL、apo M-HDL及对照组三组之间活化的信号通路的差异。结果:(1)与对照组相比,人THP-1细胞株在PMA、ox-LDL诱导下,细胞内脂质堆积明显,泡沫细胞模型诱导成功。(2)luminex检测结果显示:apo M+HDL和apo M-HDL均能下调巨噬细胞TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1的表达。apo M+HDL对TNF-α、IL-6、IL-1β的下调作用与apo M-HDL相比更为显著(P值分别为0.0411、0.0002和0.0101),同时发现与对照组相比,apo M+HDL显著上调IL-10的表达(P=0.0066)。(3)apo M+HDL、apo M-HDL及对照组相比,上调基因分别为309个和287个。根据KEGG与BIOCARTA中所有pathway的基因信息,将差异基因进行富集分析,apo M+HDL和apo M-HDL刺激组活化的信号途径基本一致,与对照组相比,活化的信号途径主要为细胞因子信号途径、MAPK信号途径。apo M-HDL和apo M+HDL刺激组相比,上调基因数为2个,分别为MMP-12、MMP-7,下调基因数为7个,分别为ZNF451、TSPYL1、IREB2、CCNL2、UTY、EZH1、RBM6,由于差异基因数量太少,无法进行pathway分析。结论:与apo M-HDL相比,apo M+HDL抗炎作用更为显著。apo M+HDL和apo M-HDL处理组活化的信号途径主要为细胞因子/细胞因子受体信号途径、MAPK信号途径、粘附分子信号途径。apo M+HDL可能在促进斑块稳定性方面具有一定的作用。第四部分apo M的表达调节及其与冠心病的易感性目的:探讨启动子区的单核苷酸多态性(SNPs)在体内对apo M表达调节作用及其对冠心病(CAD)易感性的影响。方法:采用PCR产物直接测序的方法对206例冠心病患者和209例健康对照者apo M基因启动子进行序列分析。同时采用生化方法检测研究对象的血脂水平。利用基因重组和定点突变技术构建含apo M启动子SNP的报告基因质粒,采用双荧光素酶报告系统观察各SNP位点对apo M基因启动子转录活性的影响。结果:分析了apo M基因启动子区4个SNP位点T-1628G,C-1065A,T-855C和T-778C与冠心病的相关性,同时还发现了一个新的缺失突变(-724del C)。冠心病组-1628G、-855C和-724del C等位基因频率(分别为19.2%、22.8%和8.0%)均明显高于对照组(分别为12.7%、15.6%和4.1%),P值分别为0.011、0.008和0.017。-855C突变基因携带者血浆总胆固醇水平显著高于TT基因型(P=0.000)。-724del等位基因携带者血浆总甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平明显升高(P值分别为0.003和0.000),而HDL水平下降(P=0.044),进一步研究证实,-855和-724位点发生突变后,启动子活性明显下降(P值分别为0.012和0.009)。结论:apo M基因启动子T-855C和-724del C多态性显著降低启动子转录活性,导致apo M蛋白表达水平下降,进而可能影响体内HDL和胆固醇的代谢,增加冠心病的易感性。