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目的：
MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的单链非编码RNA(长度约为20-24nts),其在生物体内的多种生物学过程中，起着重要调控作用。miR-182是人类及小鼠视网膜中表达量最高的miRNAs分子之一，然而，其在视网膜发育中的作用尚未清楚。本研究以miR-182基因敲除(KO)小鼠作为动物模型，研究miR-182在视网膜发育过程中所发挥的作用。
方法：
通过基因型鉴定，获取miR-182纯合KO鼠。利用眼底照相机(FP)及眼底荧光造影技术(FFA)，观察miR-182KO小鼠与正常对照组中眼底及血管的变化。利用高分辨光学断层相干扫描成像技术(OCT)观察P42天KO小鼠与对照组中视网膜各层厚度的改变。视网膜电图(ERG)是客观评价视网膜功能的检查方法。通过早期(1月龄)和老年(8月龄)miR-182KO小鼠以及对照组小鼠中各项ERG指标的监测，评估miR-182缺失对视网膜功能的影响。利用RT-PCR技术，分析miR-182KO小鼠以及对照组视网膜中，光感受器细胞相关基因的表达量变化。分离miR-182KO及正常小鼠视网膜，提取视网膜中RNA，利用RNA-seq测序技术及生物信息学分析，预测miR-182在视网膜中的调控靶点。miR-182KO小鼠进行急性光诱导损伤处理，探究miR-182在视网膜光损伤过程中作用。
结果：
1.收集视网膜OCT成像图片，使用Insight软件，分析IS/OS，ONL，IRL及全层视网膜厚度。统计结果表明，IS/OS层厚度在miR-182KO小鼠与对照组之间存在统计学差异(P＜0.05)，其它各层厚度无显著变化。免疫荧光染色结果表明，P42天时，光感受器细胞和双极细胞相关蛋白(Recoverin，Cone-arrestin，Rhodopsin和PKC)的分布无明显异常。FP及FFA检测中，未发现miR-182KO小鼠眼底外观及血管走行、直径大小等存在异常改变。P30天ERG检测结果中发现暗适应ERG中，miR-182KO小鼠的b波的振幅显著低于对照组(P＜0.001)；最大混合ERG应答与对照组相比，miR-182KO小鼠的a波、b波振幅均显著下降(P＜0.01)；miR-182KO小鼠明适应ERG中的a波、b波振幅明显低于对照组(P＜0.01)。8月龄时，在各类ERG反应中，miR-182KO小鼠应答均显著低于对照组，且在不同刺激强度ERG应答中，随着刺激强度的增加，miR-182KO小鼠与野生型小鼠之间的差异更为显著。
2.经qPCR检测，miR-182KO小鼠在P42天时，视杆细胞特异性表达基因Rho，Prph2表达量显著低于对照组(P＜0.01)；视锥细胞特异性表达的基因Opn1mw(P＜0.01)，Opn1sw(P＜0.001)以及Gnat2(P＜0.001)与对照组比较而言，表达量明显下降。通过视网膜RNA-seq测序，共发现119个差异性表达基因存在(Foldchange＞2,FDR＜0.05)。将所筛选的差异性基因进行GO分析，发现其涉及多个视网膜发育相关的生物学过程，如visualperception(GO：0007601)和sensoryperceptionoflightstimulus(GO：0050953)等。TargetScan数据库是目前预测miRNAs调控靶点中，较为广泛使用的数据库之一。通过结合RNA-seq测序结果TargetScan数据库的生物学信息学分析，发现Arrdc3，Ezr，Gja3，Fign和Stard13可能是miR-182在视网膜中潜在直接调控靶点。
3.成年miR-182KO小鼠及其对照组进行强光(10000 lux)照射2h的急性光损伤诱导。光照后2w，OCT检测发现小鼠的视网膜的厚度无显著变化。光照后8w，OCT检测结果提示，小鼠背、腹侧视网膜中，miR-182KO小鼠视网膜的外节明显变薄。与OCT观察一致，免疫荧光染色发现，视网膜的外节严重缺失；利用Studentt-test对miR-182KO小鼠与对照组小鼠的IS/OS层厚度进行统计学分析，发现在背侧及腹侧方向上，miR-182KO小鼠IS/OS层厚度显著变短(P＜0.01)。
结论：
1.miR-182KO小鼠中的各项ERG应答显著下降，这说明miR-182对维持正常视网膜功能过程中起着重要作用。miR-182的敲除并未引起视网膜的整体厚度及分层明显的改变，表明其对视网膜结构的形成影响较小；miR-182KO小鼠变短的IS/OS，可能与小鼠中视网膜功能下降相关。
2.miR-182敲除后，小鼠视网膜光感受器细胞中多个特异性表达基因，在mRNA水平上的表达量显著下降。miR-182KO小鼠与对照组之间，存在差异性表达的基因。部分差异性基因与视网膜疾病相关，并参与了多种视网膜发育相关的生物学过程。提示miR-182可能通过复杂的基因调控网络，参与视网膜发育过程。
3.光损伤诱导实验中，与野生型小鼠相比，miR-182KO小鼠IS/OS厚度显著变薄，表明敲除小鼠对光诱导损伤的敏感性增加，提示miR-182在光损伤中，对视网膜具有保护作用。
MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的单链非编码RNA(长度约为20-24nts),其在生物体内的多种生物学过程中，起着重要调控作用。miR-182是人类及小鼠视网膜中表达量最高的miRNAs分子之一，然而，其在视网膜发育中的作用尚未清楚。本研究以miR-182基因敲除(KO)小鼠作为动物模型，研究miR-182在视网膜发育过程中所发挥的作用。
方法：
通过基因型鉴定，获取miR-182纯合KO鼠。利用眼底照相机(FP)及眼底荧光造影技术(FFA)，观察miR-182KO小鼠与正常对照组中眼底及血管的变化。利用高分辨光学断层相干扫描成像技术(OCT)观察P42天KO小鼠与对照组中视网膜各层厚度的改变。视网膜电图(ERG)是客观评价视网膜功能的检查方法。通过早期(1月龄)和老年(8月龄)miR-182KO小鼠以及对照组小鼠中各项ERG指标的监测，评估miR-182缺失对视网膜功能的影响。利用RT-PCR技术，分析miR-182KO小鼠以及对照组视网膜中，光感受器细胞相关基因的表达量变化。分离miR-182KO及正常小鼠视网膜，提取视网膜中RNA，利用RNA-seq测序技术及生物信息学分析，预测miR-182在视网膜中的调控靶点。miR-182KO小鼠进行急性光诱导损伤处理，探究miR-182在视网膜光损伤过程中作用。
结果：
1.收集视网膜OCT成像图片，使用Insight软件，分析IS/OS，ONL，IRL及全层视网膜厚度。统计结果表明，IS/OS层厚度在miR-182KO小鼠与对照组之间存在统计学差异(P＜0.05)，其它各层厚度无显著变化。免疫荧光染色结果表明，P42天时，光感受器细胞和双极细胞相关蛋白(Recoverin，Cone-arrestin，Rhodopsin和PKC)的分布无明显异常。FP及FFA检测中，未发现miR-182KO小鼠眼底外观及血管走行、直径大小等存在异常改变。P30天ERG检测结果中发现暗适应ERG中，miR-182KO小鼠的b波的振幅显著低于对照组(P＜0.001)；最大混合ERG应答与对照组相比，miR-182KO小鼠的a波、b波振幅均显著下降(P＜0.01)；miR-182KO小鼠明适应ERG中的a波、b波振幅明显低于对照组(P＜0.01)。8月龄时，在各类ERG反应中，miR-182KO小鼠应答均显著低于对照组，且在不同刺激强度ERG应答中，随着刺激强度的增加，miR-182KO小鼠与野生型小鼠之间的差异更为显著。
2.经qPCR检测，miR-182KO小鼠在P42天时，视杆细胞特异性表达基因Rho，Prph2表达量显著低于对照组(P＜0.01)；视锥细胞特异性表达的基因Opn1mw(P＜0.01)，Opn1sw(P＜0.001)以及Gnat2(P＜0.001)与对照组比较而言，表达量明显下降。通过视网膜RNA-seq测序，共发现119个差异性表达基因存在(Foldchange＞2,FDR＜0.05)。将所筛选的差异性基因进行GO分析，发现其涉及多个视网膜发育相关的生物学过程，如visualperception(GO：0007601)和sensoryperceptionoflightstimulus(GO：0050953)等。TargetScan数据库是目前预测miRNAs调控靶点中，较为广泛使用的数据库之一。通过结合RNA-seq测序结果TargetScan数据库的生物学信息学分析，发现Arrdc3，Ezr，Gja3，Fign和Stard13可能是miR-182在视网膜中潜在直接调控靶点。
3.成年miR-182KO小鼠及其对照组进行强光(10000 lux)照射2h的急性光损伤诱导。光照后2w，OCT检测发现小鼠的视网膜的厚度无显著变化。光照后8w，OCT检测结果提示，小鼠背、腹侧视网膜中，miR-182KO小鼠视网膜的外节明显变薄。与OCT观察一致，免疫荧光染色发现，视网膜的外节严重缺失；利用Studentt-test对miR-182KO小鼠与对照组小鼠的IS/OS层厚度进行统计学分析，发现在背侧及腹侧方向上，miR-182KO小鼠IS/OS层厚度显著变短(P＜0.01)。
结论：
1.miR-182KO小鼠中的各项ERG应答显著下降，这说明miR-182对维持正常视网膜功能过程中起着重要作用。miR-182的敲除并未引起视网膜的整体厚度及分层明显的改变，表明其对视网膜结构的形成影响较小；miR-182KO小鼠变短的IS/OS，可能与小鼠中视网膜功能下降相关。
2.miR-182敲除后，小鼠视网膜光感受器细胞中多个特异性表达基因，在mRNA水平上的表达量显著下降。miR-182KO小鼠与对照组之间，存在差异性表达的基因。部分差异性基因与视网膜疾病相关，并参与了多种视网膜发育相关的生物学过程。提示miR-182可能通过复杂的基因调控网络，参与视网膜发育过程。
3.光损伤诱导实验中，与野生型小鼠相比，miR-182KO小鼠IS/OS厚度显著变薄，表明敲除小鼠对光诱导损伤的敏感性增加，提示miR-182在光损伤中，对视网膜具有保护作用。