【摘 要】
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背景:作为松果体分泌的调节生物体昼夜节律的内源性吲哚胺类激素,褪黑素被证实具有广泛的生物学功能,包括抗肿瘤,抗炎,抗氧化和神经保护作用。褪黑素的神经保护作用使其成为大多数神经损伤性疾病的潜在治疗手段,然而目前尚无研究报道其在局麻药诱导神经毒性中的作用。目的:本研究旨在探讨褪黑素对罗呱卡因诱导神经毒性的作用及机制。方法:选用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞和小鼠海马神经元HT22细胞作为研究对象,不
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背景:作为松果体分泌的调节生物体昼夜节律的内源性吲哚胺类激素,褪黑素被证实具有广泛的生物学功能,包括抗肿瘤,抗炎,抗氧化和神经保护作用。褪黑素的神经保护作用使其成为大多数神经损伤性疾病的潜在治疗手段,然而目前尚无研究报道其在局麻药诱导神经毒性中的作用。目的:本研究旨在探讨褪黑素对罗呱卡因诱导神经毒性的作用及机制。方法:选用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞和小鼠海马神经元HT22细胞作为研究对象,不同浓度的褪黑素处理24h后,CCK-8法测定细胞活力,明确褪黑素对PC12细胞和HT22细胞的毒性作用。依据前期实验的结果,选用1mM的罗呱卡因处理上述细胞构建局麻药神经毒性的体外模型。褪黑素预处理2h后,加入终浓度为1mmol/L的罗呱卡因共培养24h,48h和72h后,CCK-8检测细胞活力;光学显微镜下观察细胞形态;Western-blot检测Bax、Bcl-2和活化的Caspase-3的蛋白表达;Hoechst33258/PI染色以及Caspase-3检测试剂盒测定细胞凋亡;使用线粒体活性氧检测试剂盒以及线粒体膜电位检测试剂盒来评估细胞线粒体功能;最后,使用western-blot和免疫荧光检测线粒体自噬水平。为进一步探讨褪黑素抑制罗呱卡因诱导的细胞凋亡和线粒体自噬间的联系,使用自噬激活剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA预处理后,检测细胞凋亡和线粒体自噬水平。结果:（1）与对照组相比,治疗剂量的褪黑素对PC12细胞和HT22细胞不产生毒性作用。与罗呱卡因组比较,褪黑素预处理可以明显抑制罗呱卡因诱导的细胞活力的下降,且呈浓度依赖,差异有统计学意义（p<0.05）。同时褪黑素预处理减少了罗呱卡因引起的上述细胞形态的变化。（2）与对照组相比,罗呱卡因促进了 Bax,活化Caspase3的蛋白表达,抑制Bcl-2蛋白水平,增加凋亡坏死细胞数量和Caspase3活力,促进细胞凋亡,而褪黑素预处理则抑制了罗呱卡因诱导的细胞凋亡。（4）与对照组相比,罗呱卡因增加PC12细胞中线粒体活性氧的生成,降低线粒体膜电位,从而诱导线粒体功能障碍,而褪黑素预处理则改善了罗呱卡因对PC12细胞线粒体功能的损伤。（5）与对照组相比,罗哌卡因增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值,促进Beclin1、PINK1、Parkin的表达,抑制p62、Tomm20、COXIV蛋白水平,同时增加自噬体与线粒体间的共定位,促进细胞线粒体自噬。而褪黑素预处理抑制了罗哌卡因诱导的线粒体自噬。（6）与褪黑素+罗哌卡因组比较,雷帕霉素解除了褪黑素对罗哌卡因诱导细胞线粒体自噬的抑制,进一步减弱了褪黑素对罗哌卡因诱导凋亡的保护作用;相反的,3-MA增强褪黑素的抗线粒体自噬功能,同时也增加了褪黑素的细胞保护作用。结论:褪黑素预处理抑制罗哌卡因诱导的神经毒性,包括改善细胞活力的下降和细胞形态的变化,抑制细胞凋亡,挽救功能受损的线粒体,可能是通过抑制过度的线粒体自噬实现。
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