论文部分内容阅读
杉木花粉生物学特性是其生殖生长过程中的重要环节，将对其种子的生长及质量造成影响。本文利用福建省尤溪国有林场三代种子园中30个无性系为供试材料，分别开展了花粉形态观察、花粉体外萌发能力测定、花粉萌发过程的代谢组学分析以及基于人工授粉的杉木花粉和种子形态与萌发特征指标的相关性分析等方面的研究，以期通过上述研究初步阐述：(1)不同无性系杉木花粉的形态特征差异；(2)不同无性系杉木花粉的萌发能力差异；(3)强萌发能力与弱萌发能力无性系花粉在萌发过程中的不同时期其代谢水平的差异与特征；(4)种子的形态特征与萌发特征与花粉之间的关系。
研究获得以下几方面的主要结果：
在花粉形态方面，扫描电镜(SEM)观测结果表明，参试各无性系的花粉粒粒径均在(25.1-50μm)，属于中等大小花粉；其中偏平球形花粉约占83.33%，扁长形花粉约占10%，扁圆形花粉约占6.67%；90%的花粉萌发孔为环带状，仅有10%左右的花粉萌发孔为单沟状；有57%的花粉粒其外壁为穿孔型外壁，43%的花粉粒其外壁为非穿孔型外壁。此外，花粉粒的外壁依光滑程度不同还可分为粗糙型外壁、光滑型外壁、具有颗粒的光滑型外壁、具有颗粒的粗糙型外壁和具有环状颗粒型外壁。
开展30个无性系的花粉离体培养试验，并从中筛选出9无性系，研究培养基添加不同浓度蔗糖(0,5,10和15％)和硼酸(0，0.01,0.1和0.2％)，以及不同pH值(4.5,5,5.8和7)对杉木花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明，蔗糖对杉木花粉萌发和花粉管生长具有显著影响，15%和10%浓度的蔗糖培养条件下花粉平均萌发率(79.09%)和花粉管平均长度最大(0.53μm)。硼酸在较低浓度下可促进花粉萌发，而浓度过高则会抑制花粉萌发和花粉管生长。最佳硼酸浓度为0.01%，花粉平均萌发率为80.06%，花粉管平均长度为0.58μm。在培养基pH为7.0时杉木花粉平均萌发率和花粉管平均长度最大，分别为75.14%和0.53μm。
代谢组学分析是鉴定特定生物学过程中的代谢物差异的有效手段。本研究在对三十多个不同无性系的花粉的萌发能力进行初步鉴定后，从中筛选出两个萌发能力差异较大的两个无性系(强花粉萌发型无性系CL4和弱花粉萌发型无性系CL7)，并通过花粉离体培养促进萌发，对其萌发不同时期代谢产物进行检测与分析，从而讨论杉木萌发过程中的代谢水平上的差异与变化。基于前期体外花粉萌发过程的观测，选择在花粉离体培养的三个阶段(1h、24h和48h)取样与分析。主成分分析(PCA)结果表明，不同无性系、不同萌发时间的杉木花粉样品有明显的分离程度，反映2个无性系的杉木花粉在不同的萌发时间其代谢物化学成分存在明显的差异性。根据LC-MS总粒子流色谱结果中峰面积、保留时间、精准分子量等参数，对杉木花粉样本主要色谱峰的化学结构进行鉴定，筛选出171个峰，并最终鉴定出其中60个峰的对应代谢物。这些差异代谢物可分6大类，包括维生素及其衍生物、糖苷类化合物、酚类物质、脂类物质、氨基酸及多肽类物质以及其他含N化合物。根据两个无性系代谢物在不同时期的表达状况，可将差异代谢物分为5类。A类代谢物在花粉萌发初期于两个无性系中的表达量均较低，但在花粉萌发至24和48小时时，这类代谢物在CL4中的表达量仍旧极低，而在CL7中出现了较高的表达。B类代谢物在花粉萌发初期于两个无性系中的表达量也较低，随着花粉萌发进程，其在两个无性系中的表达量均有所升高。C类代谢物在花粉萌发初期于在CL7中的表达量显著高于CL4，萌发24小时和48小时时，这类物质在两个无性系中的表达量均降至较低水平，差异不显著。D类代谢物在花粉萌发初期于两个无性系中均有较高的表达量，在萌发后24小时时，在CL4中的表达量虽有下降，但总体表达量仍处于较高水平，而CL7的表达量则迅速下降，呈下调趋势，其与CL4的表达量有显著差异。在萌发后48小时时，CL4的D类物质表达量进一步下降，而CL7的D类物质表达量则与24小时时的表达量相似，此时两个无性系的表达量差异已不显著。E类物质在花粉萌发过程中于两个无性系中的表达量差异最大。在CL4中，这类物质始终保持较高水平的表达量，而在CL7家系中，除少数几种代谢物在花粉萌发初期有相对较高的表达量外，其余表达量均极低。差异代谢物被定位到KEGG数据库并且获得它们的富集代谢途径。还研究了涉及代谢途径的差异代谢物。代谢产物主要富集在15种主要代谢途径中，主要代谢途径在不同时期有所不同。
进行人工授粉和自然授粉条件下不同家系种子质量比较以研究父母本本对种子特征的影响。以4套杂交授粉设计(G1：以CL13无性系为母本，30个无性系为父本进行杂交，主要考察不同父本对种子特征的影响；G2：分别以CL4、CLl6和CL26为母本，每个母本授予不同的10个父本无性系花粉，主要验证不同父本对种子特征的影响；G3：分别以CL17、CL37和CL54为父本，施予CL4、CL7、CL13、CL16和CL35母本上，以考察和验证不同母本对种子特征的影响；G4：收集G1-G3中CL4、CL7、CL13、CL16、CL26和CL35人工授粉的种子，将其与同一无性系上自然授粉的种子相比较，以考察人工授粉过程是否对种子特征造成影响)，来评估花粉与种子各项参数之间的关联性。T检验结果显示，G1、G2和G3中人工授粉对种子特征均没有显着影响。此外，种子各参数的方差分析(ANOVA )结果表明，在所有受控授粉组中，组间长度，种子宽度和种子厚度之间存在显着差异，而花粉萌发和花粉大小与种子特征相关性较弱，种子特征(长度，宽度和厚度)与种子萌发呈显著正相关。除此之外，遗传因子，单独或与外部因素结合，可能在种子特征的变异中起重要作用。
综上所述，本研究的结果将有助于进一步了解杉木树种生殖生长过程，增加对花粉形态，花粉发育过程中授粉需求和生理变化的理解。对于种子的良种繁育而言，选择萌发能力高的个体作为种子园建园材料对整体产量而言具有较高的实际意义。
研究获得以下几方面的主要结果：
在花粉形态方面，扫描电镜(SEM)观测结果表明，参试各无性系的花粉粒粒径均在(25.1-50μm)，属于中等大小花粉；其中偏平球形花粉约占83.33%，扁长形花粉约占10%，扁圆形花粉约占6.67%；90%的花粉萌发孔为环带状，仅有10%左右的花粉萌发孔为单沟状；有57%的花粉粒其外壁为穿孔型外壁，43%的花粉粒其外壁为非穿孔型外壁。此外，花粉粒的外壁依光滑程度不同还可分为粗糙型外壁、光滑型外壁、具有颗粒的光滑型外壁、具有颗粒的粗糙型外壁和具有环状颗粒型外壁。
开展30个无性系的花粉离体培养试验，并从中筛选出9无性系，研究培养基添加不同浓度蔗糖(0,5,10和15％)和硼酸(0，0.01,0.1和0.2％)，以及不同pH值(4.5,5,5.8和7)对杉木花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明，蔗糖对杉木花粉萌发和花粉管生长具有显著影响，15%和10%浓度的蔗糖培养条件下花粉平均萌发率(79.09%)和花粉管平均长度最大(0.53μm)。硼酸在较低浓度下可促进花粉萌发，而浓度过高则会抑制花粉萌发和花粉管生长。最佳硼酸浓度为0.01%，花粉平均萌发率为80.06%，花粉管平均长度为0.58μm。在培养基pH为7.0时杉木花粉平均萌发率和花粉管平均长度最大，分别为75.14%和0.53μm。
代谢组学分析是鉴定特定生物学过程中的代谢物差异的有效手段。本研究在对三十多个不同无性系的花粉的萌发能力进行初步鉴定后，从中筛选出两个萌发能力差异较大的两个无性系(强花粉萌发型无性系CL4和弱花粉萌发型无性系CL7)，并通过花粉离体培养促进萌发，对其萌发不同时期代谢产物进行检测与分析，从而讨论杉木萌发过程中的代谢水平上的差异与变化。基于前期体外花粉萌发过程的观测，选择在花粉离体培养的三个阶段(1h、24h和48h)取样与分析。主成分分析(PCA)结果表明，不同无性系、不同萌发时间的杉木花粉样品有明显的分离程度，反映2个无性系的杉木花粉在不同的萌发时间其代谢物化学成分存在明显的差异性。根据LC-MS总粒子流色谱结果中峰面积、保留时间、精准分子量等参数，对杉木花粉样本主要色谱峰的化学结构进行鉴定，筛选出171个峰，并最终鉴定出其中60个峰的对应代谢物。这些差异代谢物可分6大类，包括维生素及其衍生物、糖苷类化合物、酚类物质、脂类物质、氨基酸及多肽类物质以及其他含N化合物。根据两个无性系代谢物在不同时期的表达状况，可将差异代谢物分为5类。A类代谢物在花粉萌发初期于两个无性系中的表达量均较低，但在花粉萌发至24和48小时时，这类代谢物在CL4中的表达量仍旧极低，而在CL7中出现了较高的表达。B类代谢物在花粉萌发初期于两个无性系中的表达量也较低，随着花粉萌发进程，其在两个无性系中的表达量均有所升高。C类代谢物在花粉萌发初期于在CL7中的表达量显著高于CL4，萌发24小时和48小时时，这类物质在两个无性系中的表达量均降至较低水平，差异不显著。D类代谢物在花粉萌发初期于两个无性系中均有较高的表达量，在萌发后24小时时，在CL4中的表达量虽有下降，但总体表达量仍处于较高水平，而CL7的表达量则迅速下降，呈下调趋势，其与CL4的表达量有显著差异。在萌发后48小时时，CL4的D类物质表达量进一步下降，而CL7的D类物质表达量则与24小时时的表达量相似，此时两个无性系的表达量差异已不显著。E类物质在花粉萌发过程中于两个无性系中的表达量差异最大。在CL4中，这类物质始终保持较高水平的表达量，而在CL7家系中，除少数几种代谢物在花粉萌发初期有相对较高的表达量外，其余表达量均极低。差异代谢物被定位到KEGG数据库并且获得它们的富集代谢途径。还研究了涉及代谢途径的差异代谢物。代谢产物主要富集在15种主要代谢途径中，主要代谢途径在不同时期有所不同。
进行人工授粉和自然授粉条件下不同家系种子质量比较以研究父母本本对种子特征的影响。以4套杂交授粉设计(G1：以CL13无性系为母本，30个无性系为父本进行杂交，主要考察不同父本对种子特征的影响；G2：分别以CL4、CLl6和CL26为母本，每个母本授予不同的10个父本无性系花粉，主要验证不同父本对种子特征的影响；G3：分别以CL17、CL37和CL54为父本，施予CL4、CL7、CL13、CL16和CL35母本上，以考察和验证不同母本对种子特征的影响；G4：收集G1-G3中CL4、CL7、CL13、CL16、CL26和CL35人工授粉的种子，将其与同一无性系上自然授粉的种子相比较，以考察人工授粉过程是否对种子特征造成影响)，来评估花粉与种子各项参数之间的关联性。T检验结果显示，G1、G2和G3中人工授粉对种子特征均没有显着影响。此外，种子各参数的方差分析(ANOVA )结果表明，在所有受控授粉组中，组间长度，种子宽度和种子厚度之间存在显着差异，而花粉萌发和花粉大小与种子特征相关性较弱，种子特征(长度，宽度和厚度)与种子萌发呈显著正相关。除此之外，遗传因子，单独或与外部因素结合，可能在种子特征的变异中起重要作用。
综上所述，本研究的结果将有助于进一步了解杉木树种生殖生长过程，增加对花粉形态，花粉发育过程中授粉需求和生理变化的理解。对于种子的良种繁育而言，选择萌发能力高的个体作为种子园建园材料对整体产量而言具有较高的实际意义。