拟南芥线粒体胞苷二磷酸二酰甘油合酶的研究

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胞苷二磷酸二酰基甘油(CDP-DAG)是原核生物和真核生物中甘油磷酸脂生物合成的重要中间体。在不同细胞器中,CDP-DAG合酶(CDS)可催化合成特定的阴性磷酸甘油脂合成前体。前人的研究表明拟南芥CDSs是由一个小基因家族(被命名为CDS1-CDS5)编码的膜内的整合蛋白。其中,CDS1、CDS2和CDS3位于内质网,为质体外磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(PI)的生物合成提供必需的前体,从而保证拟南芥能够完成正常的营养生长。而CDS4和CDS5位于质体,为质体的结构和功能乃至整个植株的光自养生长能力所必需。线粒体作为另一个脂质合成的场所,然而到目前为止,没有证据表明线粒体是如何为线粒体内膜特异性甘油磷脂合成提供所必需的CDP-DAG。本研究以酿酒酵母线粒体特异性CDP-DAG合成酶基因TAM41的同源基因CDS6为研究对象,取得如下研究结果:(1)与拟南芥中其它的包含多个跨膜结构域的CDSs不同,CDS6不是一个整合蛋白,仅在氨基酸序列C端包含一个跨膜结构域。CDS6基因有6个剪接体,其中CDS6.2、CDS6.3和CDS6.6具有相同的编码序列但非翻译区域序列不同。CDS6.4转录本最短,可能导致编码的蛋白缺乏线粒体定位信号肽。利用来自不同器官的总RNA进行实时荧光定量PCR分析,结果表明不同的CDS6剪接体的表达有时间和空间的特异性。(2)通过在烟草叶片中瞬时表达GFP融合蛋白证明了CDS6是一个线粒体特异性蛋白,该蛋白能够正确定位并生成线粒体PG和CL合成所必需的CDP-DAG。(3)用酵母tam41突变体进行CDS6的互补实验。表达CDS6基因后突变致死的表型被挽救,该结果有力地证明了CDS6具有CDS活性。(4)为了了解CDS6在体内的功能,对敲除了CDS6的拟南芥突变体cds6进行了鉴定。虽然杂合突变体的表型与野生型相似,但纯合突变体表现出严重的生长缺陷:部分种子不能正常萌发,部分种子可发芽但幼苗子叶苍白,另一部分突变体幼苗可发育并呈绿色。即便如此,所有纯合突变体都是仅能存活不过3周。由此可知,CDS6在幼苗形态建成和生长过程中起着不可或缺的作用。(5)透射电镜分析显示,纯合突变体的子叶的未完全发育的叶绿体中积累了大量的淀粉,WT消耗殆尽的油体仍在纯合子中大量存在,线粒体内膜结构(嵴)缺失。电镜观察到的油体也在苏丹红染色实验中也被检测到。(6)通过饲喂实验发现,纯合突变体cds6在添加了PG和CL后,部分恢复了生长能力,提示PG和CL不足可能是线粒体结构和功能缺陷的原因。综上所述,CDS6被证明是线粒体CDP-DAG合成的催化酶,用于线粒体膜中PG和CL的生物合成。CDS6的缺失会导致线粒体的结构和生理状态缺陷,阻碍油体降解,从而导致形态建成和生长发育缺乏必需的能量和物质,最终脂质死亡。
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