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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科多年生草本植物,根入药,具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等活性,在临床上可用于心脑血管疾病、癌症及各种炎症的治疗。近年来,伴随着丹参药材需求的日益扩大和野生资源的逐渐减少,提高丹参药材活性成分的含量、培育优质新品种已成为丹参资源开发中亟待解决的关键问题之一。丹参的活性物质分为两大类：一类为水溶性的酚酸类物质,包括咖啡酸、丹参素、迷迭香酸、丹酚酸、紫草酸等；另一类为脂溶性的丹参酮类化合物,包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮等。鉴于传统中药以水煎服的用药方式,丹参的水溶性成分逐渐成为近年来研究的热点。迷迭香酸是丹酚酸B等复杂酚酸类活性物质的核心结构单元,丹酚酸B是由迷迭香酸衍生而来。苯丙烷类代谢途径和酪氨酸代谢途径共同参与了迷迭香酸的生物合成。目前该途径上的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4-香豆素辅酶A连接酶(4CL)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)、羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)等多数酶基因已被克隆,但这些酶基因的调控基因还不清楚,各个酶基因对迷迭香酸积累贡献的大小也没有系统的报道。本论文在已有研究的基础上,进一步克隆参与丹参迷迭香酸生物合成的相关酶和转录因子基因,并以其中的酶基因为主要研究对象,分析这些基因的表达与迷迭香酸及其衍生的丹酚酸B等酚酸类成分积累之间的相关性,利用RNAi的方法探讨这些酶基因在迷迭香酸和丹酚酸B合成过程中的作用,筛选影响丹参迷迭香酸合成的关键基因,为丹参次生代谢物质的调控、分子育种及品质成因等研究奠定基础。主要研究内容及结论如下：1.利用PCR方法在丹参中克隆获得一条R2R3-MYB类转录因子基因MYB4, Genbank注册号为GU586494。该基因由两个外显子和一个内含子组成,包含一个长为693bp的开放阅读框(ORF),编码230个氨基酸。氨基酸序列含有两个保守的MYB DNA结合结构域以及MYB4类转录因子的保守基序LNLDL,且与拟南芥中C4H因的负调控因子MYB4和MYB32具有较高的相似性。实时荧光定量PCR分析结果显示,丹参MYB4基因在根、茎、叶中均有表达,但在叶中表达量最高。茉莉酸甲酯(MeJA)可以在一定程度上抑制该基因的表达,而光照和脱落酸(ABA)则可以诱导其表达。不同部位及不同处理阶段丹参MYB4基因表达的变化趋势与C4H基因相反,推测丹参MYB4转录因子可能作为C4H基因的转录抑制子发挥作用。2.克隆了一条酰基转移酶基因家族成员迷迭香酸合酶类似基因(RAS-like)及其5’侧翼序列,Genbank注册号分别为GU64719、GU647200。该基因开放阅读框长为1284bp,编码一个由427个氨基酸组成的蛋白,含有BAHD酰基转移酶家族的保守基序HXXXD和DFGWG,与丹参同科植物紫苏中报道的迷迭香酸合酶(RAS)具有较高的相似性。RAS-like基因在丹参的根、茎、叶中均有表达,其中茎中表达量最高。该基因的启动子序列含病原菌诱导响应元件Box W1、MeJA响应元件以及多种光作用元件。进一步利用实时荧光定量PCR分析发现RAS-like基因的表达可以受黄瓜细菌性角斑病菌、MeJA,光照、水杨酸(SA)的诱导。通过RNAi方法降低丹参中RAS-like基因的表达可以引起迷迭香酸及其衍生的丹酚酸B含量的降低,但干涉株系中总酚和总黄酮含量以及抗氧化活性变化不显著,推测RAS-like基因可能编码·迷迭香酸合酶参与丹参迷迭香酸的生物合成。3.利用DNA Walking方法克隆了丹参C4H基因的5’侧翼序列,Genbank注册号为GQ896332。在此基础上进一步分析了丹参迷迭香酸途径相关酶基因(PAL、C4H、4CL、TAT, HPPR, RAS-like基因)启动子区域的顺式作用元件,并对不同基因启动子序列的顺式作用元件进行了归类比较。结果显示,光响应元件是存在最多且最普遍的作用元件。其次,MeJA响应元件和ABA响应元件以及MYB结合位点也在多数基因的启动子区域存在,由此推测光照、MeJA、ABA、MYB转录因子等因素可以通过同时调节迷迭香酸途径相关酶基因的表达来影响迷迭香酸及其衍生的丹酚酸B的生物合成。4.利用实时荧光定量PCR和高效液相色谱技术分别检测了光照处理和MeJA处理后迷迭香酸合成相关酶基因的表达变化以及对应条件下迷迭香酸和丹酚酸B的含量。在此基础上,采用典型相关分析的统计方法,将丹参迷迭香酸代谢途径相关酶基因的表达和目标代谢物的积累水平进行整合分析,构建了“基因表达-代谢物积累”关联谱。对基因与产物的相关性分析发现,PAL1、PAL2、C4H、4CL2、HPPR基因是光照条件下迷迭香酸合成的关键基因。PAL1、 C4H、HPPR基因是光照条件下丹酚酸B合成的关键基因。5.利用RNAi方法降低PAL、C4H、4CL、TAT、HPPR等迷迭香酸途径相关酶基因的表达,分析各基因在丹参酚酸类物质积累及抗氧化过程中的作用。结果显示,抑制上述基因的表达均能在不同程度上降低丹参总酚和总黄酮的含量以及抗氧化活性,说明上述各基因在丹参的酚酸类成分代谢中均发挥着重要作用。此外,抑制上述各基因的表达均能降低丹参中迷迭香酸和丹酚酸B的含量,其中,T4T基因的影响最为显著,其次是PAL基因。对各基因干涉株系进一步比较分析发现,在非诱导条件下,PAL1、4CL2和RAS-like基因是迷迭香酸生物合成的关键基因,而TAT基因则在迷迭香酸和丹酚酸B的合成过程中均发挥关键作用。