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本研究选择具有多巴胺能神经元特性的常用于PD 发病机制研究的SH-SY5Y细胞系,以PQ诱导来观察HIPPI在mRNA水平和蛋白水平表达变化趋势,同时,对caspase 3的表达变化趋势进行检测,探讨HIPPI 在PQ诱导的SH-SY5Y细胞凋亡中参与的信号通路,为阐明HIPPI在PQ引起SH-SY5Y细胞凋亡机制中的重要作用提供参考依据。
材料与方法：
1、MTT方法分析不同浓度的PQ及不同的作用时间对SH-SY5Y细胞生存能力的影响;
2、RT-PCR和Real-time PCR方法分析PQ诱导SH-SYSY后HIPPI的mRNA表达变化;
3、WB和IF方法分析PQ诱导SH-SYSY后HIPPI蛋白水平表达的变化;
4、WB方法检测PQ诱导SH-SYSY细胞后caspase3酶原形式的表达变化,并且分析HIPPI在神经细胞凋亡机制中的作用;
5、WB方法检测PQ诱导SH-SY5Y细胞经加入caspase广谱抑制剂后HIPPI和caspase3酶原形式的表达变化;
6、分子克隆构建pcDNA-HIPPI重组体,然后将重组的质粒DNA转入SH-SY5Y细胞中,过表达的细胞经PQ诱导后,观察HIPPI及caspase3酶原形式的变化。
结果：
1、SH-SY5Y细胞经过PQ作用后,生存力明显降低,并且随着PQ作用浓度的加大和作用时间的延长,细胞的生存活力呈现出越来越明显的降低趋势,即存活的正常细胞数目越来越少。结果显示PQ在500μM作用24 h时,细胞的存活状况与非处理组比较有明显差别,适合选择此条件建立PQ诱导的SH-SY5Y细胞毒性模型;但如进一步增大PQ浓度和延长作用时间,存活的细胞数量过少,不宜进行下一步实验研究。
2、提取毒素诱导及对照组SH-SY5Y细胞的RNA,经紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测质量,然后进行反转录及特异性基因的PCR扩增,8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。半定量的结果显示,PQ处理的SH-SY5Y细胞与对照组比较,HIPPI的mRNA量呈现出降低的趋势。
3、采用Real-Time PCR的方法进一步验证mRNA水平上HIPPI在PQ处理及非处理组的SH-SY5Y中的表达变化。结果与半定量检测一样,HIPPI的mRNA显示出降低趋势。
4、应用特异性HIPPI抗体经WB检测PQ处理及非处理的SH-SY5Y细胞中HIPPI的表达变化,结果显示未能检测到特异性表达蛋白。然而,采用免疫荧光分析上述细胞,结果显示经PQ处理的SH-SY5Y细胞较非处理组的HIPPI表达量低。
5、采用脂质体法将重组的pcDNA-flag-HIPPl分别转染SH-SY5Y及HEK293细胞,应用WB法检测重组体在不同细胞系中的过表达。结果显示HIPPI成功的在HEK293细胞中表达,但是在SH-SY5Y细胞中的表达量非常低。进一步在过表达HIPPI的HEK293细胞中,采用PQ诱导及应用caspase广谱抑制剂进行处理,结果显示添加了caspase广谱抑制剂的HIPPI表达量明显高于对照组。
结论：
1、成功建立了PQ诱导SH-SY5Y细胞的毒性模型,可用于进一步的多巴胺能神经细胞变性坏死的机制分析。
2、首次发现PQ诱导的SH-SY5Y细胞毒性模型中,HIPPI的表达量在mRNA水平上低于未经PQ处理的对照组。
3、PQ诱导的SH-SY5Y细胞毒性模型中,由于采用WB方法HIPPI在蛋白水平上的表达改变较难鉴定;本研究采用IF法可观察到HIPPI的表达量低于未经PQ处理的对照组。
4、首次发现PQ诱导的SH-SY5Y细胞毒性模型下HIPPI表达降低的同时,caspase3的酶原形式也降低,提示HIPPI是caspase3介导的SH-SY5Y细胞凋亡信号通路中的一个重要因素。