动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)的发病机制十分复杂,脂质浸润、慢性炎症、血流剪切应力、内皮细胞损伤以及氧化低密度脂蛋白(oxidative low density lipoprotein,ox LDL)等诸多因素参与其中,多数学者认为细胞内脂质蓄积和泡沫细胞形成是As发生发展的核心环节。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)和巨噬细胞是泡沫细胞的主要来源,新近研究发现,人体As斑块中超过50%的泡沫细胞源于VSMCs,说明VSMCs在As发生发展过程中占据重要地位,抑制VSMCs脂质蓄积以及VSMCs源性泡沫细胞形成对As防治具有非常积极的意义。三磷酸腺苷结合盒转运体(ATP binding cassette transporter,ABCA1)是一种细胞膜结合蛋白,介导细胞内游离胆固醇流出(Free cholesterol,FC)至乏脂的载脂蛋白A-1(apolipoprotein,apo A-1)上,进一步形成高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL),这一过程是胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport,RCT)的起始步骤,也是维持细胞内胆固醇平衡的关键,对抑制血管内泡沫细胞形成,缓解As进展具有重要作用。临床研究显示,冠心病患者As病变程度与VSMCs内ABCA1的表达水平呈负相关;动物和细胞实验表明,ABCA1表达减少是引起VSMCs内胆固醇蓄积的主要原因,以上提示上调VSMCs内ABCA1表达可能是防止细胞内脂质过渡蓄积,抑制VSMCs源性泡沫细胞形成的关键靶点。心肌素(Myocardin,MYOCD)是一种核蛋白,也是目前已知强有力的VSMCs特异性基因转录共激活因子之一。有研究指出MYOCD与As性心脑血管疾病密切相关,MYOCD在冠心病患者冠状动脉中表达明显下降;过表达MYOCD能抑制血管炎症和VSMCs异常增殖、迁移;MYOCD还可以促进VSMCs的小凹蛋白-1形成,而小凹蛋白-1是介导细胞内胆固醇向胞膜移行的关键蛋白,提示MYOCD参与VSMCs胆固醇代谢的调控。因此,本研究着重探讨MYOCD能否上调ABCA1表达并调控VSMCs胆固醇流出这一科学问题。血清应答因子(serum response factor,SRF)是在VSMCs、心肌细胞等细胞和组织中广泛表达的转录因子,它能够特异性结合下游靶基因启动子区域的CAr G-box序列,从而调节下游靶基因的转录。研究显示,MYOCD以“三明治”形式与SRF结合,即两个MYOCD分子与一个SRF分子形成复合物,共同络合靶基因序列的CAr G-box,从而增加SRF与CAr G-box结合的稳定性,加强了SRF转录活性,促进靶基因的表达。以上表明MYOCD发挥基因转录调节功能与SRF密不可分。因此,我们推测SRF可能参与MYOCD对VSMCs内ABCA1基因表达的调控过程。Micro RNA(mi RNAs)是长度约22个核苷酸的单链非编码RNA,通过与靶基因m RNA的3’-UTR结合发挥生物学效应。本课题组前期研究发现,mi R-27a/b、mi R-467b、mi R-186等多种mi RNAs参与As发生发展过程。Mi R-1192于2013年被发现,基因组学分析表明mi R-1192(Gene ID:100316672)位于19号染色体19b;19 17.91 c M位点。研究显示,mi R-1192抑制损伤后的细胞修复,参与细胞分化的调节,并且mi R-1192还可促进炎症反应,提示mi R-1192可能具有促As的生物学效应。生物信息学预测分析显示,MYOCD 3’-UTR存在mi R-1192结合位点,而SRF、ABCA1的3’-UTR无mi R-1192的结合位点。说明,mi R-1192具有靶向抑制MYOCD的生物学基础,并且对MYOCD下游基因表达无干扰。因此,本研究关注的第二个科学问题是MYOCD的上游的调控机制,探讨mi R-1192是否对MYOCD具有靶向抑制作用,为开展以MYOCD为靶点的As防治策略提供思路。综上,我们提出这一工作假说:“MYOCD通过SRF上调ABCA1表达,促进胆固醇流出,抑制泡沫细胞形成和As发生发展;mi R-1192靶向抑制MYOCD,下调ABCA1表达,抑制胆固醇流出,发挥促As作用”。为验证假说,我们设计了4部分实验。首先,我们观察MYOCD对ABCA1表达和VSMCs胆固醇流出的影响。接着,我们探讨MYOCD上调ABCA1的具体机制,研究MYOCD能否与SRF结合,SRF是否具备结合ABCA1基因启动子能力。第三,我们观察MYOCD是否上调小鼠动脉ABCA1表达,并影响apo E-/-小鼠动脉粥样硬化的进展。最后,我们研究MYOCD的上游调控机制,探讨mi R-1192能否靶向结合MYOCD m RNA的3’-UTR并抑制其表达,进而减少ABCA1介导的VSMCs胆固醇流出。本研究有望为As防治提供新的靶点和理论依据。第一部分MYOCD上调ABCA1抑制VSMCs胆固醇蓄积目的:观察MYOCD对ABCA1表达和VSMCs胆固醇流出的影响,探讨MYOCD是否通过上调ABCA1表达促进VSMCs胆固醇流出,抑制VSMCs胆固醇蓄积。方法:培养人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells,T/G HA-VSMCs),用50μg/ml ox-LDL处理HA-VSMCs 96小时,使其荷脂,构建得到VSMCs源性泡沫细胞模型。用100n M的MYOCD过表达或沉默载体处理荷脂的VSMCs 24小时,观察MYOCD对VSMCs细胞内胆固醇流出和细胞内脂质含量变化的作用。采用液体闪烁技术检测VSMCs内胆固醇流出水平,高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)检测VSMCs内总胆固醇(total cholesterol,TC)、游离胆固醇(free cholesterol FC)和胆固醇酯(cholesterol ester,CE)的含量。构建过表达或沉默MYOCD载体载体,转染VSMCs,采用实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR,q RT-PCR)和Western blot方法分别检测ABCA1 m RNA和蛋白水平,观察MYOCD对VSMCs的ABCA1表达的影响。MYOCD与sh ABCA1共转染VSMCs,检测细胞内胆固醇流出水平,探讨MYOCD是否以ABCA1依赖的方式介导的胆固醇流出。结果:液体闪烁计数器检测显示,MYOCD过表达载体转染促进VSMCs源性泡沫细胞胆固醇流出。HPLC检测显示MYOCD过表达能明显减少VSMCs源性泡沫细胞内TC、FC和CE含量。q RT-PCR和Western blot检测发现,过表达MYOCD可显著上调ABCA1 m RNA和蛋白表达水平,沉默MYOCD则显著下调ABCA1 m RNA和蛋白表达水平。干扰ABCA1能够消除MYOCD对VSMCs胆固醇流出的促进作用,提示MYOCD以ABCA1依赖的方式促进VSMCs胆固醇流出。小结:MYOCD上调VSMCs内ABCA1 m RNA和蛋白水平,促进VSMCs胆固醇流出,降低VSMCs内TC、FC和CE水平。第二部分MYOCD结合SRF促进VSMCs的ABCA1表达目的:探讨MYOCD是否通过结合SRF上调ABCA1表达,促进ABCA1介导的VSMCs胆固醇流出。方法:利用Promo Home Page等生物信息学在线网站预测分析ABCA1启动子序列是否存在SRF的结合位点。利用染色质免疫共沉淀(Ch IP实验)检测SRF与ABCA1启动子结合能力,判断结合位点。免疫共沉淀检测MYOCD与SRF的结合情况。将MYOCD、SRF与野生型或突变型ABCA1启动子区报告基因载体共转染至HEK 293T细胞,采用双荧光素酶报告基因法检测启动子活性。采用沉默或过表达载体分别转染sh SRF、MYOCD、MYOCD+SRF和MYOCD+sh SRF,q RT-PCR和Western blot方法检测ABCA1 m RNA和蛋白水平,利用液体闪烁计数器检测VSMCs的胆固醇流出水平。结果:生物信息学分析发现ABCA1启动子区序列存在SRF结合位点CAr G-box,人ABCA1启动子序列存在两处可能结合位点Site1和Site2。Ch IP实验证实SRF能够络合ABCA1序列。免疫共沉淀检测发现MYOCD能与SRF结合。双荧光素酶报告基因检测发现MYOCD不与ABCA1启动子直接结合,SRF与ABCA1启动子区结合,但MYOCD与SRF共结合明显增加ABCA1启动子活性。分别构建过表达MYOCD和沉默SRF载体,q RT-PCR和Western blot检测发现,与对照组相比,MYOCD与SRF结合后能显著上调ABCA1 m RNA和蛋白水平。液体闪烁计数器检测发现MYOCD与SRF结合后能明显促进VSMCs内胆固醇流出。小结:MYOCD通过SRF上调VSMCs内ABCA1 m RNA和蛋白水平,促进VSMCs胆固醇流出。第三部分MYOCD抑制apo E-/-小鼠动脉粥样硬化形成目的:观察MYOCD对apo E-/-小鼠主动脉ABCA1表达的影响,对小鼠血脂水平、主动脉窦As斑块面积的影响。方法:以6周龄雄性po E基因敲除(apo E-/-)小鼠为研究对象,随机分为对照组、MYOCD组和sh MYOCD组,分别转染病毒载体,r Ad-MYOCD、r Ad-sh MYOCD以及r Ad-,过表达或抑制apo E-/-主动脉MYOCD表达。用高脂/高胆固醇饮食喂12周后处死,利用眼球后取血法收集各组小鼠血液,分离血清,通过化学发光法检测血清谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)水平。获取小鼠的主动脉标本,采用q RT-PCR和Western blot法分别检测各组标本ABCA1 m RNA和蛋白表达以及炎症因子表情况。获取小鼠心脏标本行冰冻切片,免疫荧光和免疫组化染色检测主动脉瓣斑块处MYOCD表达情况。分离各组apo E-/-小鼠主动脉弓,体视显微镜下观察主动脉弓及其三大分支(左锁骨下动脉、左颈总动脉、头臂干动脉)As斑块面积。利用油红O染色法观察apo E-/-小鼠主动脉血管壁内脂质蓄积情况。HE以及Masson染色法观察apo E-/-小鼠主动脉窦As斑块面积、脂质蓄积和胶原含量的情况。结果:化学发光法检测证实过表达人MYOCD和沉默人MYOCD不影响apo E-/-小鼠ALT、ALP和AST水平,提示MYOCD不影响肝脏代谢脂质的功能。q RT-PCR和Western blot检测发现MYOCD能明显促进ABCA1 m RNA和蛋白表达,炎症因子表达减少。过表达MYOCD能显著减少主动脉弓及主动脉窦内As斑块面积,降低主动脉血管壁内脂质蓄积含量,并增加As斑块内的胶原含量。而沉默MYOCD则明显增加主动脉弓及主动脉窦内As斑块面积,促进主动脉内脂质蓄积,减少As斑块内胶原含量。小结:MYOCD上调apo E-/-小鼠主动脉ABCA1 m RNA和蛋白水平,减少apo E-/-小鼠主动脉As斑块面积。第四部分Mi R-1192靶向抑制MYOCD减少VSMCs胆固醇流出目的:探讨mi R-1192是否通过靶向结合MYOCD m RNA 3’-UTR抑制其表达,减少ABCA1介导的VSMCs胆固醇流出。方法:利用生物信息学在线网站预测mi R-1192与MYOCD m RNA的靶向结合能力,并预测其结合自由能情况。将mi R-1192 mimic与野生型和突变型MYOCD 3’-UTR报告基因载体共转染至HEK 293T细胞,采用荧光素酶报告基因检测mi R-1192与MYOCD 3’-UTR靶向结合能力。并构建p GL3-ABCA1-3’-UTR、p GL3-SRF-3’-UTR重组质粒,再分别与mi R-1192 mimic共转染入HEK 293T细胞,采用荧光素酶报告基因检测mi R-1192与ABCA1或SRF结合情况。将mi R-1192 mimic和inhibitor转染小鼠主动脉VSMCs,q RT-PCR和Western blot分别检测MYOCD m RNA及蛋白水平。以HA-VSMCs为观测对象,分别转染MYOCD、mi R-1192 mimic、mi R-1192 mimic+MYOCD,利用q RT-PCR和Western blot法分别检测ABCA1的m RNA及其蛋白水平,利用液体闪烁计数器检测VSMCs内胆固醇流出的水平。结果:多个靶标预测网站分析发现mi R-1192具有靶向结合MYOCD的生物学基础。采用荧光素酶基因检测发现mi R-1192 mimic与野生型MYOCD 3’-UTR共转染后其荧光素酶活性与mimic-neg对照组相比明显降低,而MYOCD突变组的荧光素酶活性与对照组相比无明显变化。mi R-1192 mimic分别与ABCA1或SRF共转染HEK 293T细胞后,两组的均不能改变荧光素酶活性。q RT-PCR和Western blot检测发现,mi R-1192mimic能显著降低MYOCD m RNA和蛋白表达水平。与MYOCD组相比,mi R-1192 mimic能通抑制ABCA1 m RNA和蛋白表达。液体闪烁计数器检测发现mi R-1192 mimic能明显抑制VSMCS内胆固醇流出。小结:Mi R-1192靶向抑制MYOCD表达,下调VSMCs内ABCA1m RNA和蛋白水平,减少ABCA1介导的胆固醇流出。结论1、MYOCD上调VSMCs内ABCA1 m RNA和蛋白水平,促进VSMCs胆固醇流出,降低VSMCs内TC、FC和CE水平。2、MYOCD通过SRF上调VSMCs内ABCA1 m RNA和蛋白水平,促进VSMCs胆固醇流出。3、MYOCD上调apo E-/-小鼠主动脉ABCA1 m RNA和蛋白水平,减少apo E-/-小鼠主动脉As斑块面积。4、Mi R-1192靶向抑制MYOCD表达,下调VSMCs内ABCA1 m RNA和蛋白水平,减少ABCA1介导的胆固醇流出。