缺血性脑血管病是严重影响人类健康的主要疾病，其发生原因主要是由于血管重度狭窄或堵塞导致的脑组织血液供应不足。目前，临床上多选择颈内动脉内膜剥脱术、血管内支架置入术及颅内外血管搭桥术等方法恢复缺血脑区的血液供应，但是再灌注性脑损伤已经成为影响缺血性脑血管病疗效的主要因素之一。所以，探讨缺血再灌注性脑损伤的发生机制以及防治措施对提高缺血性脑血管病的治疗效果具有积极的意义。在本研究中，我们从“神经元”及“突触联系”两个方面探讨了缺血再灌注性脑损伤的发生机制及潜在的防治措施。主要做了三部分实验，分别研究了自噬对缺血再灌注神经元损伤的影响，以及人参皂甙Rb1的干预作用和机制；人参皂甙Rb1的保护作用与PI3K/Akt信号通路的关系；以及GEF-H1通路对脑缺血再灌注后神经元可塑性功能恢复的影响。第一部分自噬在缺血再灌注性神经元损伤中的作用及人参皂甙Rb1的干预研究目的：探讨自噬对缺血再灌注神经元损伤的影响及人参皂甙Rb1的干预作用和机制。方法：采用体外研究和体内研究相结合的研究模式。体外研究采用SH-SY5Y细胞糖氧剥夺模型模拟缺血再灌注性神经元损伤。采用MTT法测定细胞生存率、AO和MDC染色观察自噬的发生、锇铀铅染色透射电镜观察自噬的形成、AO染色流式细胞仪计数、蛋白印迹分析自噬相关蛋白表达。体内研究采用雄性Wistar大鼠双侧颈总动脉夹闭结合股动脉抽血降压法制作全脑缺血再灌注模型。采用HE染色、免疫组织化学染色、激光共聚焦显微镜、锇铀铅染色透射电镜、蛋白印迹分析等方法检测自噬相关蛋白的表达变化。结果：体外研究结果，MTT法测定结果显示，人参皂甙Rb1处理组，细胞存活率增加；透射电镜检查显示，糖氧剥夺组细胞的胞浆内较广泛地形成了具有双层膜特点的自噬泡；MDC染色荧光显微镜观察发现，同对照组相比较，糖氧剥夺组细胞核周围呈斑点状的绿色荧光强度增高，但是人参皂甙预处理组的斑点状荧光强度显著下降；蛋白印迹分析显示，人参皂甙Rb1不仅抑制了糖氧剥夺所致自噬相关蛋白Becklin1和LC3的表达，还抑制了LC3I向LC3II的转化。体内研究结果，HE染色光镜下所见15分钟全脑缺血72小时再灌注组神经元呈死亡神经元的形态学特点，人参皂甙预处理组神经元的形态学特点介于假手术组和缺血再灌注组之间；光镜下计数人参皂甙Rb1干预后存活率增加；透射电镜检查显示，同假手术组相比较，海马CA1区神经元的胞浆内形成了自噬泡；LC3免疫组化染色激光共聚焦显微镜观察发现，再灌注24小时后海马CA1区神经元中自噬相关蛋白LC3蛋白的表达较假手术组显著增加，但是20mg/kg和40mg/kg人参皂甙预处理显著抑制了缺血再灌注所致LC3蛋白在海马CA1区神经元中的表达；蛋白印迹分析显示，同假手术组比较，再灌注24小时后自噬相关蛋白Beclin1和LC3I的表达显著提高，而且LC3I向LC3II的转化增多，然而20mg/kg和40mg/kg人参皂甙预处理不仅抑制了Beclin1和LC3I的表达，而且抑制了LC3I向LC3II的转化。结论：缺血再灌注后的海马CA1区神经元的死亡是过度激活了自噬；人参皂甙Rb1对缺血再灌注性神经元死亡的保护作用与其抑制自噬的过度激活有密切的关系。第二部分人参皂甙Rb1抑制缺血再灌注后神经元自噬性死亡中PI3K/Akt信号通路的作用目的：探讨人参皂甙Rb1抑制缺血再灌注后神经元自噬性死亡中PI3K/Akt信号通路的作用。方法：采用体外研究和体内研究相结合的研究模式。体外研究采用SH-SY5Y细胞糖氧剥夺模型模拟缺血再灌注性神经元损伤。体内研究采用雄性Wistar大鼠双侧颈总动脉夹闭结合股动脉抽血降压法制作全脑缺血再灌注模型。采用MTT法检测细胞增殖活力，蛋白印迹分析检测自噬相关蛋白及PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达变化。结果：体外研究部分，MTT法检测细胞增殖活力显示，人参皂甙Rb1组细胞存活率显著增加，LY294002+人参皂甙Rb1组的细胞存活率较人参皂甙Rb1组显著下降；蛋白印迹分析显示，OGD后复氧12和24小时OGD组磷酸化Akt、Beclin1和LC3II的蛋白水平较对照组均显著升高；在人参皂甙Rb1预处理组，除外磷酸化Akt的表达水平较OGD组显著升高，自噬相关蛋白Beclin1和LC3II的蛋白水平较OGD组均显著下降；但是，PI3K抑制剂LY294002逆转了由人参皂甙Rb1所调节的磷酸化Akt高表达、Beclin1和LC3II低表达的情况。体内研究部分，HE染色光镜下计数结果显示，LY294002+人参皂甙Rb1组显著低于人参皂甙Rb1组海马CA1区存活的神经元以及DMSO+人参皂甙Rb1组。蛋白印迹分析显示，缺血再灌注组磷酸化Akt、Beclin1和LC3II的蛋白水平较假手术组显著升高；人参皂甙Rb1组和DMSO+人参皂甙Rb1组的磷酸化Akt蛋白水平较缺血再灌注组显著升高的同时，自噬相关蛋白Beclin1和LC3II的蛋白水平却较缺血再灌注组显著下降；但是，LY294002逆转了由人参皂甙Rb1所调节的磷酸化Akt高表达、Beclin1和LC3II低表达的情况。结论：人参皂甙Rb1是通过激活PI3K/Akt信号通路，对缺血再灌注后海马CA1区神经元自噬性死亡产生抑制作用。第三部分GEF-H1通路对短暂性脑缺血再灌注后神经可塑性恢复影响的研究目的：研究脑缺血后GEF-H1通路的变化及作用机制，为神经元在经受缺血损伤后的功能恢复寻找新的治疗靶点。方法：本实验首先建立Wistar大鼠的双侧血管结扎的短暂性前脑缺血（2VO）模型。于麻醉状态下结扎双侧颈总动脉20分钟，然后恢复血流供应，分别选择0.5，4，24或者72小时的再灌注时间。对不同恢复时间脑组织的组织学研究采用HE染色，Western Blotting检测，免疫组化及共聚焦显微镜，电子显微镜，脱磷酸化以及pull-down分析等研究方法，来研究在脑缺血发生后GEF-H1通路的相关蛋白表达变化。结果：HE染色光镜下计数结果显示，20分钟的脑缺血在这个模型中主要在72小时的再灌注时发生迟发性神经元死亡，相比较DG区，CA1区和皮层区的神经元更容易受到损伤，皮层的神经元也会发生迟发性神经元坏死，尽管相对于CA1区程度更小；蛋白印迹分析显示，总GEF-H1含量未见明显变化，但是却在脑缺血后从P3转移至P1和P2部分，并从上带转移至下带。CIP处理后的分析表明，GEF-H1蛋白在脑缺血发生后很有可能从神经微管上解离并紧密合并进入了PSDs中；GEF-H1蛋白活性或是脱磷酸化作用在缺血再灌注的早期，在损伤和修复的区域同样的发生着显著的上升。然而，在缺血再灌注的后期，在迟发性神经元死亡的区域，GEF-H1蛋白是下降的，但是却在同样经历了缺血损伤后存活下来的神经元内发生了显著的升高。免疫组化及共聚焦显微镜结果显示，在脑缺血再灌注后30分钟和4小时，GEF-H1蛋白水平在所有大脑区域内基本没有改变或者只是发生了微小的下降，同时在皮层区转移至细胞核内。但是在24小时和72小时再灌注时间点上，与对照组相比，在易受损的CA1和一些皮层区，发生了进一步的下降，但是在抵抗脑缺血损伤能力较强的DG区，发生了明显的增高。在72小时再灌注组中，大部分的海马背侧CA1区的神经元发生了死亡，它们都发生了细胞核固缩并呈多角形的形态学变化；锇铀铅染色透射电镜结果表明神经微管在脑缺血发生后发生了持续的解离，RhoApull down检测发现，与对照组相比较，有活性的RhoA在脑缺血后发生了显著性增高，而总量基本没有变化。结论：GEF-H1在缺血再灌注后的不同时期作用不同，初始阶段GEF-H1的增高可能加重神经元损伤，恢复阶段GEF-H1蛋白的增高可以提高神经元可塑性，促进神经元功能恢复。