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菊花(Chrysanthemlum×moriforlium Ramat.)作为重要的观赏植物,起源于中国并在世界范围内广泛栽植,其具有品种庞杂、花型和花色多样、遗传变异丰富等特点,这使得研究菊花品种分类和遗传多样性存在一定的困难。SSR标记作为一种重要的分子标记技术已被广泛应用于植物遗传多样性研究,在菊花品种分类和遗传多样性分析方面也有一定进展。传统的SSR标记开发方法过程复杂,成本高,随着转录组测序技术的兴起,根据转录本设计SSR引物方便易操作且可批量筛选SSR位点,还可与物种的特定性状相联系。栽培菊花多为六倍体,因其基因组复杂,至今尚没有报道其基因组测序结果。因此根据菊花转录组测序数据来开发SSR标记对菊花的分类研究具有重大的现实意义。本课题组前期以传统栽培菊花品种‘金背大红’、‘禾城星火’和‘泉乡水长’为实验材料进行全长转录组分析。本研究基于全长转录组测序结果开发SSR标记,以多种菊花品种为实验材料,通过PCR扩增和生物信息学分析等方法研究了转录本中SSR位点分布、SSR扩增多态性的区域偏好性、特定SSR标记扩增情况与菊花性状之间的关联、并运用所建立的SSR标记对经5-azaC或EMS处理材料的SSR位点变化等情况进行了分析,所获得的研究结果如下:1.采用第三代单分子实时测序技术对菊花品种‘金背大红’、‘禾城星火’和‘泉乡水长’进行了全长转录组测序,以MISA6软件搜索高质量非冗余FLNC中所含有的所有SSR位点。对菊花品种‘金背大红’全长转录组中SSR分布区域进行分析,发现基因转录本的5’ UTR区域的SSR位点数最多(28,651个),3’UTR次之(19,903个),CDS区域最少(15,972个)。以菊花‘金背大红’全长转录组中SSR位点为基础,在三种不同区域(5’ UTR、3’ UTR及CDS区域)分别设计SSR引物,共筛选得到28个SSR标记位点,有效扩增率为29.79%。以30个菊花品种为材料,通过对这28个SSR标记多态性分析发现,5’ UTR区的引物扩增多态性最高(80.78%),3’ UTR区次之(76.87%),CDS区最低(74.16%)。2.在菊花‘禾城星火’和‘泉乡水长’花部组织的全长转录组开发的SSR标记中,筛选出位于调控花部性状相关基因上的16个SSR标记。以83个菊花品种为材料,验证筛选的SSR标记的多态性与菊花花部性状的相关性,结果表明:分别位于VDE、TCP2、MADS-box Protein CMBI和MADS6基因上的 2PB-9、3PB-6、2PB-10、2PB-1 和 2PB-12 SSR标记,其多态性可明显的与菊花的花色性状和瓣型性状聚类到一起。3.在菊花‘禾城星火’花部组织的全长转录组开发的SSR标记中,筛选出8个位于调控花色相关基因上的SSR标记。以117个不同花色性状菊花品种的花瓣组织的DNA和cDNA为材料,分别从基因组和转录组水平分析SSR标记的多态性与菊花的花色性状的相关性,结果表明:位于花青素合成途径中CHS和CHI基因上CHS和CHI-3 SSR标记以及位于胡萝卜素代谢途径中LCYE、PSY和VDE基因上LC YE-1、PSY和VDE SSR标记,其多态性可明显的与菊花的花色性状聚类到一起。4.用不同浓度5-azaC处理的‘泉乡水长’和‘金丝皇菊’菊花品种插穗叶片为材料,分析SSR标记多态性变化。结果表明:用300 μmol/L 5-azaC处理菊花5 d时SSR标记多态性更容易发生变化。5-azaC(100 μmol/L,3 d)处理12个不同菊花品种插穗,以处理株系的花瓣为材料,在基因组和转录组水平上分析SSR标记多态性的变化。结果表明:‘珠紫盘龙’、‘唐宇天菊’和‘瀑水流冰’菊花品种的SSR位点更易受5-azaC处理的影响。5.为了检测筛选到的SSR标记多态性是否受菊花甲基化水平的影响,以5-azaC处理的‘紫精灵’组培苗、‘紫精灵’MET1-RNAi和野生型组培苗的叶片为材料,分析在这些材料中SSR标记多态性的变化。结果显示:2PB-7、2PB-11、2PB-16、2PB-17、3PB-3和3PB-15这6个SSR标记多态性的变化可能受到DNA甲基化的影响。6.以EMS处理甘菊G1株系组培苗的叶片为材料,分析EMS处理对SSR标记多态性及植株生长发育的影响。结果表明:EMS处理对SSR标记多态性有影响;EMS处理时间越长,处理浓度越高,甘菊组培苗存活率越低;株高也受EMS处理的影响,大多数处理样品株高变矮。综上所述:SSR标记在菊花全长转录组5’ UTR区扩增多态性最高,3’ UTR区次之,CDS区最低;定位于TCP2、MADS-box Protein CMBI和MADS6基因的SSR标记与菊花的某些花部性状有相关性;定位于CHS、CHI、LCYE、PSY和VDE基因的SSR标记与菊花的某些花色性状有相关性;菊花插穗再生植株和组培苗中SSR标记的多态性受5-azaC或EMS处理影响。