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单核增生性李斯特杆菌(Listeria Monocytogenes，LMO)是一种重要的人畜共患食源性疾病致病菌，可引起人和动物的脑膜炎、败血症等疾病，病死率非常高。李氏溶血素(Listeriolysin O，LLO)由LMO分泌，是LMO特有的毒力因子，在其感染机体的过程中，发挥极为重要的作用。本实验以原核表达系统pGEX-6P-hly／BL-21表达的重组LLO，经纯化作为免疫抗原，免疫BALB／c小鼠，以LMO—0586于BHI培养基中分泌的天然LLO为筛选抗原，检测抗LLO单克隆抗体。经过细胞融合，建立间接ELISA方法，采用有限稀释法，经三次亚克隆，获得6株稳定分泌抗LLO单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为ⅠF5、ⅡC4、ⅡE5、ⅢG7、ⅣB7、ⅣE9。经亚类鉴定其中ⅠF5、ⅡC4、ⅣE9、ⅡE5分泌的单克隆抗体为IgG1型，ⅣB7、ⅢG7分泌的单克隆抗体类型为IgM型，所有都是κ链抗体；杂交瘤细胞染色体数目平均在85-103条；间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价ⅠF5、ⅡC4为1：512，ⅣE9、ⅣB7、ⅢG7为1：256，ⅡE5细胞培养上清效价为1：128；以分泌性较好的ⅡC4细胞株大量制备腹水单抗，经检测其效价为1：10~5，Western blot检测该单克隆抗体具有很好的反应特异性；阻断ELISA检测溶血素实验发现此单抗对天然李氏溶血素有较好的结合能力，不与葡萄球菌、链球菌、丹毒杆菌所分泌的溶血素结合，说明所制备的抗重组LLO单克隆抗体对病原检测具有高度的特异性。本研究还以纯化的重组LLO包被ELISA微量反应板，以制备的腹水单抗为诊断抗体，然后用此诊断抗体分别与BHI培养基和TSB-YE培养基培养的不同时段的LMO上清发生反应，初步在实验室建立了阻断ELISA检测LMO的方法。使用TSB-YE培养基，其检出时间和检菌限值分别为增菌后5h和9.5×10~5个／ml，使用BHI培养基其检测时间和检菌限值分别为增菌后5.5h和2.7×10~6个／ml，实验中还发现从不同培养基繁殖细菌效果看，相同的培养时间BHI培养基的增菌数要大于TSB-YE培养基，而从细菌产生LLO的能力上看，使用TSB-YE培养基要明显强于BHI培养基，可以更早的检出LMO，这为进一步研制LMO快速检测试剂盒奠定了基础。