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薯蓣皂素(Diosgenin)来源于薯蓣科单子叶草质缠绕藤本植物,如山药、黄姜、黄药子、穿山龙等的根茎,是生产氢化可的松、强的松、炔诺酮、肤轻松、地塞米松等多种甾体类药物的重要基础原料。研究表明,薯蓣皂素具有抗氧化、抗血管钙化、抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗病毒和抗休克等作用;但在生殖方面的研究,报道甚少,有研究初步证实,薯蓣皂素能够改善轻度雄性衰老性生殖障碍,提高精子活性;但薯蓣皂素对睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)作用的研究还未见报道。因此,进一步研究薯蓣皂素对雄性生殖的影响,可能为男性不育防治提供新的思路。SCs在精子生成过程中,可以在近基底室建立一个提供结构支撑、营养和免疫保护的独特和重要的环境,具有营养支持、分泌、免疫豁免及吞噬等多种功能。由于雌激素在维持雄性生殖活动中具有不可替代的作用。SCs是未成熟动物雌激素的主要来源,雌激素不仅可以直接促进SCs的增殖、分化和成熟,而且可以通过间接影响促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)的分泌,调节SCs有丝分裂;同时,又由于雌激素主要是通过其受体(Estrogen receptor,ESR)信号通路来完成调控男性精子生成的作用。因此,研究薯蓣皂素对SCs的作用及其对ESR信号传导途径的影响,不仅为探讨该药治疗男性不育的作用及机制,而且为其进一步药物研发提供实验依据。第一部分:薯蓣皂素对SCs增殖的影响目的:通过观察薯蓣皂素干预后,小鼠睾丸来源的SCs(TM4)细胞系的增殖、周期分布及凋亡,探讨薯蓣皂素对SCs增殖的影响。方法:1)MTT法及Brdu法检测薯蓣皂素干预后,SCs(TM4)的增殖情况。2)流式细胞术及Western Blot法检测薯蓣皂素干预后,SCs(TM4)的周期分布及G0/G1期标志蛋白CDK4/CDK6、cyclin D1、CDK2、cyclin E与G2/M期标志蛋白cdc2、cyclin B的表达。3)TUNEL法及Western Blot法检测薯蓣皂素对干预后,SCs(TM4)凋亡及凋亡相关蛋白Bax、AIF、Caspase 3、Caspase 9和Bcl-2的表达。结果:1)不同薯蓣皂素浓度均可促进SCs(TM4)增殖(P<0.05),以2.5μM最为显著;2.5μM薯蓣皂素干预SCs(TM4)6-48 h,在6、12、24、48 h等不同时间点均可见细胞活力增加(P<0.05),但以24h时达最大值。2)2.5μM薯蓣皂素干预SCs(TM4)24h,G0/G1期细胞数量明显减少(P<0.05),而S期的细胞群显著增加(P<0.05),G2/M期细胞群没有显著改变(P>0.05);G0/G1期的标志蛋白CDK4/CDK6、Cyclin D1、CDK2与Cyclin E表达明显增加(P<0.05),而G2/M期标志蛋白cdc 2和Cyclin B表达无显著影响(P>0.05)。CDKs抑制因子P27的表达稍有下降(P>0.05)。3)2.5μM薯蓣皂素干预SCs(TM4)24 h,能显著抑制细胞凋亡(P<0.05);明显抑制凋亡相关因子Bax、AIF、Cleaved Caspase3和Cleaved Caspase 9的表达,增加Bcl-2蛋白表达(P<0.05)。结论:薯蓣皂素能够促进小鼠SCs(TM4)的增殖,且存在一定的量效与时效关系;同时促进其细胞周期过渡和抑制其凋亡。第二部分:薯蓣皂素调控ESR及其ERK/Akt信号通路促进SCs增殖的机制目的:通过观察薯蓣皂素对SCs(TM4)中ESR及其ERK/Akt信号通路的影响,探讨其促进SCs增殖的机制。方法:1)以2.5μM薯蓣皂素干预,及在此基础上分别加入1n M抗雌激素ICI和5n M酪氨酸激酶选择性抑制剂PP2,Western Blot法检测SCs(TM4)核和质膜中的ESR1、ESR2的蛋白表达。MTT和Brdu标记法、流式细胞术、TUNEL法检测SCs(TM4)的增殖、周期分布及凋亡。2)薯蓣皂素干预SCs(TM4)后,及在薯蓣皂素干预的基础上,分别加入ICI、PP2及ERK抑制剂U0126及和Akt抑制剂LY294002后,Western Blot法检测不同时间点ERK和Akt磷酸化;MTT和Brdu标记法检测SCs(TM4)的增殖。3)薯蓣皂素干预后,采用Wstern Blot法检测SCs(TM4)细胞核上ESR表达;荧光素酶报告基因检测SCs(TM4)的ESR的转录活性。4)CHIP检测薯蓣皂素干预后,SCs(TM4)ESR的晚期活动。结果:1)2.5μM薯蓣皂素干预SCs(TM4)0-30min,在5min、15min、30min时间点质膜上ESR1和ESR2蛋白表达均有显著升高(P<0.05),在15min时达到最高;而核上ESR1和ESR2的蛋白表达显著降低(P<0.05),在15min时达到最低。加入ICI和PP2时,ESR1、ESR2细胞膜表达水平受到了显著抑制(P<0.05);而细胞核上ESR1、ESR2的核表达水平明显升高(P<0.05)。在加入ICI和PP2时,薯蓣皂素促进SCs(TM4)增殖的作用受到了显著的抑制(P<0.05);同时,G0/G1期细胞群数量有明显上升(P<0.05),S期的细胞群数量有明显下调(P<0.05);细胞的凋亡有显著增加(P<0.05)。2)2.5μM薯蓣皂素干预SCs(TM4)0-30min,在5min、15min、30min时均可增加ERK、Akt磷酸化水平,15min时达到最高(P<0.05)。分别加入相关抑制剂ICI、PP2、U0126及LY294002时,ERK、Akt磷酸化水平受到显著抑制(P<0.05);加入U0126及LY294002时,SCs(TM4)的细胞增殖降低(P<0.05)。3)2.5μM薯蓣皂素干预0-48h,在12h、24h、48h时间点SCs(TM4)细胞核ESR1与ESR2的表达增加,其中以干预后24h增加最为显著(P<0.05);在此基础上加入PP2时,细胞核上ESR1、ESR2的核表达水平显著升高(P<0.05);同样条件下,SCs(TM4)的ESR转录活性显著增加(P<0.05),以干预后24h增加最为显著;而在加入抑制剂ICI、PP2、U0126和LY294002后SCs(TM4)的ESR转录活动受到显著抑制(P<0.05)。4)2.5μM薯蓣皂素干预SCs(TM4)后ESR1、ESR2蛋白分子与Cyclin D1及Bcl-2基因结合水平增高显著(P<0.05)。结论:薯蓣皂素促进SCs(TM4)增殖机制:干预后激活依赖于SRC诱导的即时和瞬态ESR核质膜易位,随后激活ERK/Akt信号通路,后期通过活化核ESR的转录活性和直接调控细胞周期因子cyclin D和细胞凋亡因子Bcl-2,从而促进G1期到S期的细胞周期过渡和抑制细胞凋亡,最终导致细胞增殖。