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RNA沉默是一种在生物体内广泛存在的保守机制,它最显著的特征是能产生小RNA并以序列特异性的方式调控基因表达,小RNA主要包括miRNA和siRNA。在这些小RNA指导下,沉默系统中某些效应蛋白能对靶标进行调控。除了调控发育过程,植物中的RNA沉默还具有抗病毒功能。一些植物病毒包含卫星RNA(satRNA),它们需要借助宿主蛋白进行复制。在涉及到RNA沉默机制时,有关宿主植物、辅助病毒和卫星RNA三者间的互作关系并不清楚。
本研究发现,一个来自强致病性SD-CMV株系(CMV山东株系)卫星RNA的vsiRNA(satsiRNA)在靶向病毒RNAs后引发了宿主体内RNA依赖的RNA聚合酶6(RDR6)介导的对病毒RNAs的降解作用。在本研究中,首先利用免疫共沉淀的方法证实在植物体内satsiRNAs也具有进入AGO蛋白的生物学活性。通过生物信息学比对发现其中一个被高频率克隆到的satsiRNA即satsiR-12,与SD-CMV RNAs3’UTR上游的一段序列存在不完全匹配。利用瞬时表达系统也证实,表达人工的satsiR-12即asatsiR-12能介导GFP-sensor的剪切作用。将asatsiR-12在N.benthamiana和N.benthamiana RDR6i(RDR6被沉默)中进行组成性表达分别获得转基因植物Nbsat-12和RDR6isat-12,随后检测在CMV△2b(2b功能缺陷)和CMVwt(包含2b蛋白)侵染时asatsiR-12对CMV RNAs的靶向调控作用。结果发现,在CMV△2b侵染的Nbsat-12植物中,asatsiR-12也能介导对CMV RNAs的剪切下调,但这种下调作用在CMV△2b侵染的RDR6isat-12植物中又会消失;当用CMVwt侵染时,在两种转基因植物中都观察不到这种下调作用。这些结果表明,asatsiR-12通过靶向CMV RNA3’UTR引发了依赖RDR6的抗病毒沉默作用,而且asatsiR-12介导的、依赖RDR6的对病毒RNA的下调作用能被2b所抑制。本实验室的研究还检测到,在CMV△2b侵染N.benthamiana的后期阶段,大量复制的satRNA能引起CMV RNAs积累水平降低。在本研究中利用satsiR-12产生位置处突变的卫星RNA(satRNAm)也证实,satsiR-12的确参与到了satRNA引起的对CMV RNAs的下调过程。野生型和突变病毒RNA共存时的竞争性实验还证实,在CMV自然侵染时2b蛋白对于satsiR-12介导的对CMV RNAs的下调作用具有抑制效应。本研究提供证据表明,satsiRNAs在平衡宿主、辅助病毒和卫星RNA三者间互作间关系以确定最终侵染结果的过程中发挥了重要的调控作用。RNA沉默具有非细胞自发的特性,即沉默现象一旦产生,沉默信号分子能够从起始产生位点经由胞间连丝进行短距离的细胞间扩散或者经过韧皮部进行长距离的系统性扩散。尽管有关沉默运动的研究已经取得了不少进展,但是对于其中涉及到的分子机制仍知之甚少。本研究利用早期建立的一个可化学诱导的基因沉默系统,通过遗传学筛选获得了一系列与沉默相关的拟南芥突变体,并对其中一株沉默程度降低的突变体19-2-1进行了定位克隆和初步的功能分析。目前的结果表明,除了影响突变体的形态学表型和生长发育过程,位于拟南芥五号染色体上的突变基因很可能还参与到了沉默运动的特异性扩散环节。