研究背景2019年世卫组织研究机构发布的GLOBOCAN2018报告指出,2018年全球新发癌症约1.81亿,癌症相关死亡人数9600万,其中新发肺癌约2100万,肺癌相关死亡人数为1800万,肺癌不但是诊断人数最多,而且是癌症相关死亡人数最多的肿瘤。肺癌患者中大部分为非小细胞肺癌,小细胞肺癌仅占15%左右,全球范围内年新增病例约25万例,死亡人数至少20万,小细胞肺癌由于生长迅速且易早期扩散、转移、复发等因素,目前其5年生存率短于7%。虽然放射治疗在临床治疗中取得了一定进展,但绝大多数小细胞肺癌会复发,其中位生存期短于6个月。因发病机制不清楚,这极大的限制了小细胞肺癌的治疗。微小核糖核酸（miRNA）是大小在21-24个核苷酸的非编码核糖核酸,目前研究提示,miRNA调控机制主要是与靶基因的3’-非翻译区（3’-UTR）互补结合,从而使目标靶基因的mRNA降解或失活来发挥作用。研究显示,miRNA可参与调控机体60%左右的基因。而且,近年来的研究提示miRNA功能失调与多种癌症的发生、进展有关;有研究显示在非小细胞肺癌中上调的miRNA众多,如miR-210和miR-182为肿瘤进展促进剂,而有些下调的miRNA,如miR-451a和miR-126可能是肿瘤的抑制剂。其中,miR-451a已被证明在白血病、神经胶质瘤、胃癌和非小细胞肺癌等多种癌症中表达下调并调控癌细胞生物学行为。miR-451包括miR-451a和miR-451b两个同源物,其中前者在癌症中得到了更多的研究。有研究显示miR-451a的表达与非小细胞肺癌的不良预后呈负相关;且可以通过调控Mcl-1来增强非小细胞肺癌对常用化疗药物（如顺铂）的敏感性。然而,miR-451a是否通过靶向特定基因来调控小细胞肺癌尚不清楚。淋巴细胞特异性解旋酶（Helicase,Lymphoid Specific,HELLS）属于 SNF2家族,SNF2是SWI/SNF染色质重塑复合物中核心亚基,SNF2属于解旋酶SF2亚家族,但SNF2不具有解旋酶活性。研究表明SWI/SNF家族蛋白与人类健康息息相关,20%左右的肿瘤患者中伴有SWI/SNF染色质重塑复合物的突变。而HELLS在正常发育和生存中起着重要作用。维持DNA甲基化需要,可通过DNA甲基化控制CDKN1C基因的沉默。在异染色质的形成和组织中发挥作用。既往研究发现HELLS与癌症发展之间存在正相关关系,在多种肿瘤中,如结直肠癌、神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤中HELLS上调且与不良预后相关。例如,肝癌中HELLS表达上调,并可以调节肝细胞癌染色质重塑和多个肿瘤抑制基因的表观遗传沉默来促进肝癌的进展,并与肝癌的不良预后有关。HELLS和细胞间黏附分子在非小细胞肺癌中表达增高,是肺腺癌不良预后的指标,细胞学功能学研究发现HELLS可促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、侵袭,而HELLS对小细胞肺癌细胞是否有类似作用尚不清楚。研究目的首先下载GEO数据库中关于小细胞肺癌的数据,进行生物信息学分析后提出研究假说:miR-451a通过靶向HELLS调控mTOR信号通路调控小细胞肺癌进展。然后利用基因转染技术构建体外细胞模型来验证上述假说:（1）研究miR-451a、HELLS对小细胞肺癌细胞功能的影响;（2）miR-451a、HELLS对小细胞肺癌细胞功能影响的分子机制研究。最后收集肺癌患者组织标本,检测癌组织及癌旁组织HELLS蛋白的表达,探索HELLS蛋白在癌组织及癌旁组织表达,探索HELLS表达高低与肺癌患者的临床病理特征是否具有相关性,提出miR-451a mimic作为抗小细胞肺癌治疗的可行性及HELLS作为辅助诊断小细胞肺癌的可行性。研究方法1.第一部分:小细胞肺癌相关差异miRNA、mRNA生物信息学研究（1）小细胞肺癌相关差异miRNA生物信息学研究①利用GEO公共数据库,下载小细胞肺癌及癌旁组织miRNA相关的数据集,采用R语言对数据进行处理,把两组组织中表达具有差异的miRNA筛选出来,并对筛选得到的差异表达miRNA通过R语言进行可视化分析。②利用在线工具对筛选得到的差异表达的miRNA基因进行GO功能富集分析与生物通路富集分析。③miR-451a的靶基因的预测主要用Targetscan数据库完成。（2）小细胞肺癌相关差异mRNA生物信息学研究①利用GEO公共数据库,下载小细胞肺癌及癌旁组织mRNA相关的数据集,采用R语言对数据进行处理,把两组组织中表达具有差异的mRNA筛选出来,差异表达mRNAs的可视化分析通过计算机R语言完成。②利用R语言对差异表达mRNA进行GO功能富集分析与KEGG富集分析。③对上调的mRNA与目标miR-451a预测得到的靶基因进行交集处理得出共同基因,然后利用GSEA进行单基因分析并结合文献,选定研究对象,并筛选出可能的细胞信号通路。2.第二部分:miR-451a调控小细胞肺癌细胞功能（1）利用基因转染技术,构建小细胞肺癌体外细胞模型。（2）利用CCK-8、Trans-well小室、划痕及平板细胞克隆实验等技术,探索miR-451a、HELLS是否对小细胞肺癌细胞功能产生影响。3.第三部分:探索miR-451a对小细胞肺癌细胞功能影响的分子机制（1）采用实时荧光定量PCR检测两种人小细胞肺癌细胞（NCI-H1688和NCI-H446）及人支气管肺上皮细胞（BEAS2B）中miR-451a的表达。分析GSE19945数据集中小细胞肺癌及匹配的正常组织miR-451a的表达。（2）采用实时荧光定量PCR检测两种人小细胞肺癌细胞（NCI-H1688和NCI-H446）及人支气管肺上皮细胞（BEAS2B）中HELLS-mRNA的表达。分析GSE43346S数据集小细胞肺癌及匹配的正常组织HELLS-mRNA的表达。（3）利用Targetscan数据库查询miR-451a与HELLS的结合位点及结合序列,miR-451a与HELLS是否具有靶向关系通过双荧光素酶报告实验进行验证。（4）利用基因转染技术,构建小细胞肺癌体外细胞模型。①采用实时荧光定量PCR检测不同小细胞肺癌细胞模型中HELLS基因表达水平的变化。②采用western-blot（蛋白印迹）技术检测不同小细胞肺癌细胞模型中HELLS蛋白表达的变化。③采用细胞免疫荧光技术检测不同小细胞肺癌细胞模型中HELLS蛋白荧光强度的变化。④小细胞肺癌细胞模型中mTOR信号通路及Bcl-2/Bax凋亡信号通路蛋白采用western blot技术完成。4.第四部分分析肺癌组织中HELLS的表达和肺癌患者临床病理特征（1）从上海芯超生物科技有限公司购买的肺癌组织芯片,项目编号:HLugC120PTO1,组织芯片包含60例（对）肺癌及匹配的癌旁组织,以及肺癌患者临床资料,包括年龄、性别、症状、发病部位、病理诊断及分级、清扫淋巴结数目及转移淋巴结数目和H＆E染色结果等,芯片组织点直径为1.0mm。所有组织在采集时均遵循《赫尔辛基宣言》及具有相关许可证明,并准许用于商业及研究使用。每个组织点的病理判定依据WHO规定的分类和分级,由具有相关专业技术资格的临床医师确定。上海芯超生物科技有限公司伦理委员会审核通过此伦理。（2）采用组织免疫荧光检测技术,检测肺癌组织HELLS蛋白表达,并与肺癌患者临床症状、病理分级、是否伴有淋巴结转移相结合进行分析。（3）利用在线数据库Kaplan-Meier plot分析HELLS对肺癌患者预后的预测价值。研究结果1.第一部分为了提高小细胞肺癌早期诊断、改善预后为目的,利用GEO公共数据库,对目前已有的关于小细胞肺癌的数据进行挖掘、分析后,得出以下结果:①根据设置的条件采用计算机R语言对小细胞肺癌差异表达的miRNA进行筛选,我们一共得到了 167个差异表达的miRNA,其中癌组织表达上调的mRNA有64个,癌组织表达下调的mRNA有103个。②我们对获得的差异表达的miRNA的GO功能富集分析以及生物通路富集分析利用在线FunRich软件完成。并对结合文献和既往研究选定miR-451a为下一步研究对象。③miR-451a的靶基因选择Targetscan数据库的前100个。④根据设置的条件对小细胞肺癌差异表达的mRNA进行筛选,共获得844个差异表达的mRNA,其中癌组织表达上调基因有448个,而癌组织中表达下调的基因有396个。⑤利用R语言对差异表达mRNA进行GO功能富集分析与KEGG富集分析。GO功能富集主要参与细胞生长调节、细胞黏附、分裂、DNA合成、修复及转录的正向调节、蛋白质翻译的调控等生物学功能;在分子功能主要集中在DNA复制起始点结合、各种酶结合、激酶结合、蛋白激酶结合、RNA结合过程。KEGG主要富集在细胞周期通路。⑥对上调的mRNA与miR-451a预测得到的靶基因进行交集处理后得到4个共同基因,分别是SPC25、KIF24、HELLS和POU3F2。对筛选到的四个共同基因分别进行单基因GSEA富集分析,发现HELLS有意义通路,结合文献选择HELLS为研究对象,mTOR通路及凋亡通路为其下游通路。⑦通过GEO数据库获取患者临床资料,通过分析ROC曲线推断HELLS对小细胞肺癌具有诊断价值,结果显示其敏感性95.7%,特异性71.4%。2.第二部分（1）miR-451a可抑制小细胞肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭。（2）HELLS可促进小细胞肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭。（3）在过表达HELLS后,miR-451a对小细胞肺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的抑制作用会下降。3.第三部分（1）与人支气管肺上皮细胞比较,miR-451a在两种小细胞肺癌细胞NCI-H1688和NCI-H446中表达明显降低,与GEO数据库GSE19945数据集癌组织中miR-451a表达降低的结果一致。（2）与人支气管肺上皮细胞比较,HELLS-mRNA在两种小细胞肺癌细胞NCI-H1688和NCI-H446中表达明显升高,与GEO数据库GSE43346数据集癌组织中HELLS-mRNA表达增高的结果一致。（3）在线数据库预测了 miR-451a与HELLS3‘UTR的结合位点及结合序列。构建野生型pPGL3-HELLS3‘UTR报告质粒和突变型pPGL3-HELLS3‘UTR报告质粒,与miR-451a及正常对照共转染小细胞肺癌细胞,共转染miR-451a mimic与野生型pPGL3-HELLS3‘UTR报告质粒组的相对荧光强度较对照组明显降低,差异具有统计学意义;而转染miR-451a mimic与突变型pPGL3-HELLS3‘UTR报告质粒组的相对荧光强度与对照组差别不具有统计学意义,说明HELLS为小细胞肺癌中miR-451a的直接作用靶基因。（4）利用基因转染技术,构建小细胞肺癌体外细胞模型。①小细胞肺癌细胞NCI-H446、NCI-H1688中HELLS-mRNA的表达受miR-451a负调控,而过表达HELLS,可以部分逆转由miR-451a引起的HELLS-mRNA表达的负调控。②蛋白印迹及细胞免疫荧光结果显示:小细胞肺癌NCI-H446、NCI-H1688细胞中HELLS蛋白的表达受miR-451a负调控,而过表达HELLS,可以部分逆转由miR-451a引起的HELLS蛋白表达的负调控。③蛋白印迹结果显示,mTOR通路中,不同小细胞肺癌细胞模型中,AKT和mTOR均无差别;而p-mTOR、p-AKT在不同细胞模型中差别较大,与NC组相比,过表达miR-451a组p-mTOR、p-AKT蛋白表达水平明显下降;而过表达HELLS组p-mTOR、p-AKT蛋白表达水平明显升高;另外,与miR-451a mimic组相比,共转染组p-mTOR、p-AKT蛋白表达水平明显升高。凋亡通路中,与NC组相比,miR-451a mimic组,Bax蛋白明显升高;而过表达HELLS组Bax蛋白明显下降;与mimic组相比,共转染组Bax表达明显降低。凋亡通路中Bcl-2得到与Bax相反的结果。4.第四部分（1）肺癌患者临床资料组织芯片包含60例（对）肺癌患者,其中腺癌26例,平均年龄:57.5±7.5,男13例占50%,肿瘤大小不一,病理分级大部分在Ⅰ-Ⅱ级,大多数伴有淋巴结转移;8例小细胞肺癌患者,平均年龄60.9±11.6,均为男性患者,病理分级多数为Ⅲ级,大部分有淋巴结转移;鳞状细胞癌14例,平均年龄:63±7.7,12例男性,占85.7%,Ⅱ级病理分级为主,全部患者都伴有淋巴结转移。所有肺癌患者均无远处转移。肿瘤发病年龄多为中老年男性。（2）肺癌组织HELLS表达与病理临床特征①不论小细胞肺癌,还是肺腺癌/肺鳞癌,与癌旁正常组织相比,HELLS表达明显上调。与无淋巴结转移肺癌患者相比,伴有淋巴结转移的腺癌、小细胞肺癌,癌组织中HELLS蛋白表达更高。本组织芯片中所有肺鳞癌患者均伴有淋巴结转移。然而,无论小细胞肺癌,还是肺腺癌/肺鳞癌,其病理分级高低与HELLS蛋白表达高低差别不大。②Kaplan-Meier plot在线数据库分析显示肺腺癌组织中HELLS高表达组与低表达组相比,其总生存期及疾病无进展生存期均明显缩短。而肺鳞癌患者HELLS表达高低与预后无正相关。Kaplan-Meier plot在线数据库目前均缺乏小细胞肺癌的相关数据。结论1.小细胞肺癌的发生、发展伴随者miR-451a表达的抑制和HELLS表达的上调。2.miR-451a可抑制小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭。HELLS能够促进小细胞肺细胞的增殖、迁移和侵袭。3.miR-451a通过靶向HELLS使mTOR失活并激活凋亡信号通路,抑制小细胞肺癌进展。miR-451a mimic抑制小细胞肺癌细胞功能,有望成为小细胞肺癌的诊治提供有前景的生物标志物和靶点。