禽流感(Avian Influenza)是由A型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的禽类传染病。疾病的严重程度取决于毒株的亚型、病毒的毒力、被感染禽的种类、日龄、性别、并发症等因素。其中高致病性禽流感(High pathogenic avian influenza,HPAI)以发病急、传播迅速和致死率高为特征,常出现感染鸡群全军覆灭,给许多国家和地区的养禽业带来巨大的经济损失。更让全世界担心的是禽流感病毒可以跨越种间障碍感染人,迄今全球已有多个国家报道了禽流感感染人的事件,禽流感对人类公共卫生构成巨大的潜在威胁。目前,我国主要使用疫苗免疫接种对禽流感进行防控,免疫后禽类体内产生HI抗体,依靠HI试验监测抗体水平。但是家禽感染后,体内也会产生HI抗体,这样就不能确定HI抗体的升高是由于免疫还是感染造成的,给禽流感的流行病学监测和诊断带来困难。因此,研制禽流感疫苗免疫与野毒感染的血清鉴别方法具有重要意义。蛋白芯片技术是一种高通量分析蛋白表达,蛋白和蛋白之间相互作用以及酶活性分析的强有力的工具。蛋白芯片包含多个捕获探针,可以同时检测不同的目的蛋白,使其成为一种有效地诊断多种疾病、多种疾病相关蛋白的方法。但是,不足之处是蛋白芯片试验需要昂贵的扫描仪器。免疫胶体金技术是以钠米金为标记物,对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术。Danscher在此基础上改进并发展了免疫金银染色法,大大提高了检测灵敏度。将胶体金作为蛋白标记物应用于蛋白质芯片的研究,可以摆脱经典的阅读芯片结果必须的、昂贵的激光扫描系统,实现目视化判读结果。本项研究结合蛋白芯片和免疫胶体金技术,建立了一种可以区分禽流感疫苗免疫禽和野毒感染禽的目视化蛋白芯片诊断技术平台。在本研究中,首先扩增禽流感病毒的NS1基因,将其克隆于原核蛋白表达载体pET-30a(+)上,经PCR和测序验证正确后,重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式获得到大量表达,分子质量约为34ku,与预期相符。对表达蛋白进行变性、纯化、复性,经Western-blotting鉴定,重组蛋白具有良好的免疫反应性。利用重组NS1蛋白为抗原,建立目视化蛋白芯片诊断平台。实验中把表达的NS1蛋白稀释为250-5000μg/ml 10个梯度,进行捕获抗原浓度优化,确定3000μg/ml为最佳捕获抗原浓度。用蛋白芯片分别检测已知的AI感染血清和免疫血清各25份,SPF鸡血清、ND阳性血清、IBD阳性血清各10份。感染血清和免疫血清检测结果符合率100%,显示该方法具有良好的准确性。SPF鸡血清、ND阳性血清、IBD阳性血清检测无非特异性反应,说明蛋白芯片具有良好的特异性。用蛋白芯片对采集的不同时间点的实验感染血清进行检测,在感染第8天检出,而用琼脂扩散试验在感染第14天检出,蛋白芯片灵敏度明显高于琼扩检测方法。实验建立的蛋白芯片诊断平台,可以快速、准确的区分禽流感野毒感染和疫苗免疫家禽,检测结果仅凭肉眼即可判断,利于现地使用,是禽流感的监控和净化技术的新突破。