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[目的]1)探明甲状腺激素(Thyroid hormone,TH)对肝癌干细胞(Liver cancer stem cells,LCSCs)自我更新的调控作用。2)明确甲状腺激素受体α(Thyroid hormone receptor alpha,TRα)的表达对CSQT-2和MHCC97-H肝癌细胞的克隆形成能力的调控作用。3)明确TH/TRα信号通路对肝癌细胞体内生长的调控作用。4)探索TH/TRα信号通路与已知肿瘤干细胞调控因子表达的相关性。[方法]1)首先利用CSQT-2细胞建立肿瘤细胞低吸附培养成球模型,用以检测细胞的自我更新能力。并借助目前已知的24种不同的激素/核受体(Nuclear receptor,NR)激动剂或拮抗剂刺激肝癌细胞,筛选鉴定可能影响肝癌干细胞的激素/核受体信号通路。2)通过Realtime qPCR技术,检测TRα在不同临床标本(配对的正常肝脏组织、肝细胞癌组织和门静脉癌栓组织)中表达量的区别。3)建立特异针对TRα和TRβ(Thyroid hormone receptor beta,TRβ)的shRNA慢病毒,对TRα和TRβ进行干扰。明确是否是TRα特异介导了TH/TRα信号通路对肝癌细胞自我更新的调控作用。4)借助抗体孵育和流式细胞仪检测分析,明确特异干扰TRα是否可以有效地抑制TH/TRα信号通路对CSQT-2肝癌细胞中CD90~+细胞群的诱导作用。5)通过IC50检测,明确干扰TRα是否可以显著增加肝癌细胞对表柔比星和5-氟尿嘧啶的敏感性,证实TRα在TH/TRα信号通路调控的肝癌细胞化疗抵抗中发挥的作用。6)通过经典的连续稀释实验(serial dilution assay)用不同数量的肝癌细胞在NOD/SCID小鼠身上进行荷瘤实验,以明确干扰TRα后,是否影响肝癌细胞中LCSCs的比例及肝癌细胞在体内的增殖。7)利用Realtime-qPCR、染色质免疫共沉淀(ChIP)等手段继续探索了TH/TRα信号通路促进肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)自我更新的分子机制。[结果]在研究中,我们发现TH/TRα信号通路可以显著地促进肝癌细胞的自我更新。通过进一步的检测,发现TH/TRα信号通路也可以增加CD90~+肝癌细胞的数量并促进肝癌细胞对化疗药物的耐受性,TH主要通过其受体TRα发挥作用。此外,我们的功能研究发现,利用特异针对TRα的shRNA干扰其表达,可以显著抑制TH/TRα信号通路对肝癌细胞体外自我更新、CD90~+肝癌细胞群数量、药物耐受性以及体内成瘤生长的诱导作用。我们进一步通过分析临床肝细胞癌组织样本,发现与正常肝脏组织相比,TRα的mRNA在门静脉癌栓(portal vein tumor thrombus,PVTT)和HCC组织中的表达显著升高。而进一步的机制研究发现,敲除TRα不但可以抑制肿瘤细胞在体外的自我更新,而且可以抑制肝癌细胞在体内的生长。非常有趣的是,我们还发现在肝癌细胞中TH/TRα信号通路与NF-κB信号转导通路具有协同作用:TRα通过与NF-κB亚基p65的相互作用,共同结合癌基因BMI1的启动子区并促进了BMI1的表达;而且,NF-κB信号转导通路在TH诱导肝癌细胞自我更新的过程中是发挥作用的。[结论]我们的研究表明:TH/TRα信号通路在LCSCs的调控中具有重要的作用,可以特异性增加CD90~+肝癌细胞群的比例并促进肝癌细胞的自我更新,进而导致肝癌细胞对化疗药物的耐受性增加。从临床的观点出发,鉴定影响肿瘤干性的环境或基因因素、并进一步研究靶向TH/TRα信号通路的治疗方法,在HCC的治疗中具有潜在的应用价值。