【摘 要】
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背景免疫刺激性细胞因子白细胞介素-2（Interleukin,IL-2）在肿瘤免疫治疗中具有巨大潜力,而在临床应用中因其本身的毒副作用而受到限制。近年来,IL-2的癌症免疫治疗的最新策略通常集中在通过突变或者化学修饰来减少调节性T细胞的发育、延长半衰期和简化制备。然而,这些尝试都没能完全消除与毒副作用相关的CD25的相互作用。华盛顿大学蛋白质设计研究所的大卫·贝克研究团队从头设计了一种IL-2模拟
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背景免疫刺激性细胞因子白细胞介素-2（Interleukin,IL-2）在肿瘤免疫治疗中具有巨大潜力,而在临床应用中因其本身的毒副作用而受到限制。近年来,IL-2的癌症免疫治疗的最新策略通常集中在通过突变或者化学修饰来减少调节性T细胞的发育、延长半衰期和简化制备。然而,这些尝试都没能完全消除与毒副作用相关的CD25的相互作用。华盛顿大学蛋白质设计研究所的大卫·贝克研究团队从头设计了一种IL-2模拟蛋白——Neo-2/15,它比天然IL-2具有更强的稳定性,对人和小鼠IL-2Rβγc二聚体具有更高的亲和力,并且在小鼠体内实验中没有表现出毒副作用。在抗肿瘤细胞免疫疗法中,NK92细胞崭露头角,表现出比T细胞更好的疗效和更低的细胞毒性。而NK92细胞的增殖依赖于IL-2,目前关于Neo-2/15蛋白能否正常维持NK92细胞和嵌合抗原受体（CAR）修饰的NK92细胞（CAR-NK92）的增殖及功能活性还有待研究。本研究中使用的CAR-NK92来源自课题组前期设计构建的一种高激活型嵌合转换受体（High activity Chimeric Costimulatory Converting Receptor,Ha CCCR-NK92）改造的NK92细胞。目的（1）表达并获取IL-2模拟物Neo-2/15蛋白。（2）探讨Neo-2/15维持NK92细胞及CAR-NK92细胞体外增殖的影响。（3）探讨Neo-2/15对NK92细胞及CAR-NK92细胞体外抗肿瘤活性影响。方法（1）合成Neo-2/15蛋白编码基因并插入p ET-28a原核表达载体上,通过热激法导入E.coli BL21感受态细胞中,随后诱导表达,并用镍柱纯化Neo-2/15蛋白。（2）CCK-8法分别检测Neo-2/15和热处理后的Neo-2/15对NK92细胞及CAR-NK92细胞体外增殖的维持作用。（3）分析Neo-2/15对NK92及CAR-NK92细胞表型的影响。（4）检测经Neo-2/15培养的NK92细胞及CAR-NK92细胞对靶细胞的体外杀伤活性。（5）测定经Neo-2/15培养后的NK92细胞及CAR-NK92细胞与靶细胞共孵育后细胞因子的分泌水平。结果（1）通过质粒转染成功制备了表达Neo-2/15的E.coli BL21,经过镍柱纯化和超滤管浓缩后,SDS-PAGE验证收获了较高纯度的Neo-2/15蛋白。（2）通过细胞计数实验和CCK-8实验,热处理后的Neo-2/15蛋白组培养的NK92细胞及CAR-NK92细胞的增殖水平与热处理的重组人IL-2组相比没有显著差异,表明Neo-2/15具有良好的热稳定（P＞0.05）。（3）通过细胞计数实验和CCK-8实验,Neo-2/15蛋白组培养的NK92细胞及CAR-NK92细胞的增殖水平与重组人IL-2组相比没有显著差异,因此Neo-2/15可有效刺激NK92细胞及CAR-NK92细胞的体外增殖（P＞0.05）。（4）通过流式细胞术检测,Neo-2/15蛋白组培养的NK92细胞及CAR-NK92细胞的主要分子表型与重组人IL-2组相似,表明Neo-2/15可维持NK92细胞及CAR-NK92细胞的主要分子表型。（5）通过细胞杀伤实验和ELISA实验,Neo-2/15蛋白组培养的NK92细胞及CAR-NK92细胞的对同种肿瘤细胞的杀伤水平与重组人IL-2组相比没有显著差异,Neo-2/15蛋白组培养的NK92细胞及CAR-NK92细胞的对非小细胞肺癌H1299杀伤后的因子释放水平与重组人IL-2组相比没有显著差异,表明Neo-2/15可维持NK92细胞及CAR-NK92细胞的体外杀伤活性和主要细胞因子的分泌（P＞0.05）。结论Neo-2/15能维持NK92细胞和CAR-NK92细胞的体外增殖以及细胞毒性作用,可用于制备高活性的NK92细胞,并为CAR-NK92细胞与Neo-2/15蛋白的联合使用提供了重要依据。
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