腈水解酶（Nitrilase,EC 3.5.5.1）是一类可以将腈类物质一步水解为羧酸类物质的酶,在多种化工品及药物中间体的生产中已被应用。然而,天然腈水解酶活性较低、是限制其进一步应用的瓶颈。基于突变体库构建和筛选的定向进化已被证明是酶分子改造的有效策略,但缺乏高通量筛选方法使得腈水解酶的高活性进化研究进展缓慢。遗传编码型生物传感器能够实时检测细胞内靶标分子的浓度,调节报告基因表达,从而将酶活与细胞表型相偶联,实现体内超高通量酶活筛选。基于此,本研究利用特异性识别烟酸的转录因子构建烟酸生物传感器,并针对腈水解酶活性筛选的需求进行适应性改造,开发了腈水解酶高通量筛选平台。进一步利用该平台对来源于Synechocystis sp.PCC6803的腈水解酶Nit6803进行半理性定向进化,大幅提高其酶活,获得能够高效催化3-氰基吡啶生成烟酸的工程菌。主要研究结果如下:（1）利用枯草芽孢杆菌转录因子Bs Nad R及其靶标启动子Pnad B,以绿色荧光蛋白GFP为报告基因,在大肠杆菌中异源构建烟酸生物传感器。然而,Bs Nad R极高的灵敏度导致该传感器对烟酸检测范围极窄,难以用于酶活筛选。通过易错PCR对Bs Nad R进行改造,筛选获得灵敏度显著降低的系列突变体,并发现配体亲和力及DNA结合结构域柔性的改变是突变体具备不同调节性能的主要因素。其中,突变体AH6可以在0-50mmol·L-1的烟酸浓度下调节GFP的梯度表达,适于腈水解酶的活性筛选;（2）基于构建的高性能烟酸生物传感器开发腈水解酶体内高通量筛选平台,并利用该平台对Nit6803进行高活性进化。首先,对形成Nit6803催化口袋的关键位点分组构建随机组合突变体库,通过高通量筛选平台对构建的突变文库进行筛选。然后,基于关键位点的迭代进化,最终筛选获得高活性的组合突变体C57-E10,其催化3-氰基吡啶的比酶活达到32.3±0.11 U·mg-1,为野生型的6.6倍。通过分子对接和动力学模拟,发现C57-E10的催化口袋能够更好地结合3-氰基吡啶,从而具备更高的活性;（3）对野生型Nit6803和突变体C57-E10的3-氰基吡啶全细胞催化进行表征。发现,野生型Nit6803在600 min内无法完全催化500 mmol·L-1的3-氰基吡啶;而C57-E10能够在100 min内催化500 mmol·L-1的3-氰基吡啶,而且反应进行至285 min也可以将1 mol·L-1的3-氰基吡啶完全转化为烟酸。该结果表明,本研究获得了能够高效催化3-氰基吡啶生成烟酸的工程菌。另外,C57-E10催化2-氰基吡啶、苯甲腈、丙烯腈的比酶活相较野生型也大幅提高,分别为野生型的34.3、1.7和1.8倍,表明C57-E10具备较大的应用潜力。