拟南芥生物钟相关蛋白XCT正调节RPW8.1介导的免疫

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  本论文从筛选RPW8.1广谱抗性作用的调控因子入手,利用正向遗传学筛选方法,以RPW8.1自身启动子启动RPW8.1-YFP融合蛋白表达的纯合转基因系R1Y4为材料,用甲基磺酸乙酯(EMS)对其进行诱变处理,得到多个突变体,发现其中一个突变体(b3-17)植株明显比对照矮小,新叶偏黄,且叶片上RPW8.1介导的细胞死亡斑点减少。于是我们将该突变体与生态型Ler杂交得到F2分离群体,结合图位克隆和基因组重测序的方法发现在第2号染色体上AT2G21150位点编码的第8个内含子的3端碱基G突变为A。进一步对突变体cDNA测序发现该突变导致下游相邻外显子8个碱基的剪切移位,使得该基因提前终止,编码一个截短了79个氨基酸的蛋白,而这79个氨基酸覆盖了该基因编码的保守结构域X-chromosome Associated Protein5(XAP5)长度的1/3。再把野生型的XCT基因转入突变体中,得到的阳性植株表型全部恢复到与对照材料一致。至此,我们得到这个突变相关基因XCT,并把突变体b3-17更名为R1Y4/xct-5,同时构建了该基因在R1Y4和Col-gl背景下的干涉和过表达株系,并检测了该基因自身的抗病性以及对RPW8.1介导的抗病性的影响,主要得到以下一些结果:
  1)突变XCT削弱了RPW8.1介导的免疫响应。首先,接白粉菌后,R1Y4/xct-5产生的孢子数量显著高于R1Y4,说明对白粉菌的抗性减弱了。检测一些防御响应,包括白粉菌诱导的细胞死亡分布和双氧水累积、PAMP诱导的胼胝质沉积和防御基因的表达。所有的这些响应在突变体中都被削弱了。另外,无论接种细菌毒性菌株P.syringae DC3000还是无毒菌株P.syringae DC3000(hrcC),其在突变体中的繁殖量都显著高于R1Y4中的。这些结果表明RPW8.1介导的防御响应以及对多种病原菌的抗性需要XCT的参与。
  2)干涉XCT的表达后,叶片上自发性死亡斑点减少,接菌后对白粉菌的抗性减弱。同时病原菌诱导的细胞死亡和双氧水的产量减少,PAMP诱导的胼胝质沉积和FRK1的表达也减弱,说明降低XCT的转录水平,确实削弱了RPW8.1介导的抗病反应,也证明XCT正调RPW8.1介导的抗性。
  3)超表达XCT后,叶片上坏死斑点增多,接菌后对白粉菌和细菌的抗性菌均增强。相关防御反应诸如细胞死亡,双氧水累积,胼胝质沉积,防御基因表达等都比对照多或者强,说明过量表达XCT增强了RPW8.1介导的抗性,也说明XCT在RPW8.1介导的免疫过程中扮演着正调节子的角色。
  4)我们构建了XCT在Col-gl背景下的突变体,干涉以及超表达植株,发现这些材料对白粉菌和细菌的抗性与野生型没有显著差异,说明XCT本身可能对基础免疫没有直接贡献。
  5)通过qRT-PCR和蛋白印迹实验检测RPW8.1在不同材料中的转录和翻译水平,发现XCT不仅正向调节RPW8.1的mRNA水平,还正调控其蛋白水平,而且RPW8.1也反过来正调节XCT的转录表达,说明二者在转录水平上相互调节。
  6)乙烯下游转录因子ERF6,ERF016和ORA59在R1Y4中被抑制表达,而在XCT突变体和过表达材料中分别上调可抑制表达。说明乙烯下游信号可能参与XCT,RPW8.1介导的抗病过程。
  通过以上主要实验结果,我们得出XCT可能通过抑制乙烯下游信号正调控RPW8.1介导的细胞死亡和抗病性,这为我们进一步理解RPW8.1的抗病机制提供了线索。
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