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目的:.探讨 Fibulin-3 在非小细胞肺癌(Non-small-cellcarcinoma NSCLC)侵袭转移中发挥的作用,并探讨其可能的作用机制。方法:1.利用RT-PCR及免疫组织化学方法系统分析Fibulin-3蛋白在肺癌组织和正常肺组织的表达情况,用甲基化特异PCR(MSP)方法检测Fibulin-3在肺癌中的表观遗传失活是否由于启动子甲基化引起,系统分析其与肿瘤转移和预后的关联。2.构建fibulin-3表达载体转染入肺癌细胞A549 H1299及H460,利用细胞侵袭实验分析Fibulin-3能否抑制肿瘤细胞侵袭;建立Fibulin-3蛋白稳定表达及RNA干扰的细胞系,分析Fibulin-3失活是否促进肿瘤细胞转移。为了进一步研究Fibulin-3是否由于启动子甲基化失活而发挥抑制肺癌细胞侵袭的作用,我们使用两种Fibulin-3 siRNA转染H1752细胞(缺乏Fibulin-3启动子甲基化并且表达了正常水平的Fibulin-3蛋白)用transwell检测其侵袭能力。3.通过 RT-PCR 和 Real-Time PCR 检测转染 Fibulin-3 前后 A549 和 H1299 细胞中五种TIMP和三种MMP表达水平的变化。免疫组化检测101例非小细胞肺癌组织中Fibulin-3与MMP-7表达量间的相互关系。通过MSP和免疫组化分析32例肿瘤组织和正常组织中Fibulin-3启动子甲基化与mmp-7表达量间的关系。4.利用Western Blot检测A549和H1299转染Fibulin-3前后细胞内TCF4下游目标蛋白CyclinD1及Myc的表达来分析Fibulin-3是否影响β-catenin/tcf 4通路;检测Fibulin-3是否影响GSK3β活性。5.利用Western Blot检测A549和H1299转染Fibulin-3前后细胞核内β-catenin含量,间接免疫荧光法检测Fibulin-3对β-catenin亚细胞定位的影响6.培养A549和H1299细胞并接种于24孔板中,生长10-24小时(80%汇合度)将报告基因质粒(Fibulin-3或PcDNA3.1)与转录因子表达质粒(MMP-7或MMP-7突变体或Luc)共转染细胞;提取蛋白并用于荧光素酶检测;加入底物,测定荧光素酶的活性;计算相对荧光强度,并与空载对照比较7.将10只BALB/c裸鼠随机分为2组,每组5只,通过尾静脉注射1×106个H460细胞和稳定表达Fibulin-3的H460细胞,0.2ml/只。接种7周后将裸鼠以颈椎脱臼法处死,称重并取肺组织记录肿瘤结节数。结果:1.Real-Time PCR检测五对匹配的肺癌组织和癌旁组织(病理正常)中Fibulin-3表达量发现前者较后者Fibulin-3表达量降低。免疫组织化学检测46例癌旁组织(病理正常)中Fibulin-3阳性率达84%(37 of 46)而101例肺癌组织中阳性率仅30.7%(31 of 101),表明肺癌组织中Fibulin-3表达量明显低于正常组织(P<0.001)。DNA甲基转移酶5-aza-2’-dC处理六个肺癌细胞株后Real-time PCR检测到在其中四个细胞中Fibulin-3表达量明显升高。2.Fibulin-3转染入A549,H1299和H460后这些细胞的集落形成率较对照组明显降低,transwell结果显示稳定转染Fibulin-3的H1299细胞.侵袭能力较对照组明显下降(P<0.01)。3.Real-Time PCR检测转染Fibulin-3前后A549和H1299细胞中五种TIMP和三种MMP表达水平的变化发现只有mmp 7的表达量下降了 50%-80%。免疫组化检测101例非小细胞肺癌组织中Fibulin-3与MMP-7表达量相关性发现51.4%(52/101)肿瘤组织MMP-7呈阳性,其中60.4%(61/101)的肿瘤表达mmp 7或Fibulin-3,但只有10.9%(11/101)同时表达这两种蛋白,结果具有统计学意义(P<0.05)。32例组织样品MSP显示其中有12例Fibulin-3基因发生甲基化,在这12例中有10例mmp 7蛋白表达是阳性的(83.3%),而Fibulin-3基因未发生甲基化的20例组织样本中只有8例mmp 7蛋白表达逞阳性(40%)。4.Fibulin-3明显抑制A549和H1299细胞中c-myc和Cyclin D1的表达,进一步的分析显示,Fibulin-3刺激后糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的磷酸化水平升高。5.间接免疫荧光法用于分析转染FBL 3前后直肠癌SW480细胞(细胞核内含有丰富的β-catenin)中β-catenin定位变化。结果表明,Fibulin-3转染细胞后细胞核内β-catenin的含量较对照组明显降低,GSK3β参与β-catenin从细胞质入核的过程。6.Fibulin-3是经由β-catenin/tcf4信号通路发挥抑制肺癌侵袭作用,我们发现在A549和H1299细胞中转染Fibulin-3,明显抑制tcf 4报告基因的活性。Fibulin-3通过野生型β-catenin以及突变的β-catenin(去除降解所需的N-末端的磷酸化位点(△N))都能抑制TCF-4报告基因的转录。β-catenin/TCF-4直接绑定到MMP-7的启动子区域TBE区,以驱动其转录激活作用,Fibulin-3可以抑制这一过程。7.7周后,接种H460细胞的裸鼠肺转移结节明显多于接种Fibulin-3-H460细胞的裸鼠,接种H460细胞的裸鼠的体重也明显低于接种Fibulin-3-H460细胞的裸鼠。结论:Fibulin-3有抑制肺癌侵袭的作用,在大多数非小细胞肺癌中Fibulin-3由于启动子甲基化表达降低,其抑制肺癌侵袭的机制可能是通过影响β-catenin/TCF-4通路而下调mmp 7的表达从而使癌细胞侵袭能力下降。