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研究背景:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和致死率均居前列。CRC恶性生长和转移是一个多步骤、多阶段、多因素相互作用的综合生物学过程。现有研究已表明,其发生机制主要涉及肿瘤细胞抗凋亡、增殖、侵袭、上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)及血管生成等。在这其中,蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinases,PTKs)及其介导的信号传导通路扮演了十分重要的角色。PEAK1(Pseudopodium-enriched atypical kinase 1),又称Sgk269(Sugen kinase 269),是新近发现的一类非典型激酶,主要调控p130Cas/Crk/Rac1和Ras/Raf/ERK信号途径。最近研究表明,PEAK1参与人类多种肿瘤生长、远处转移的过程,但其在CRC进程中的具体分子机制及其潜在的临床应用价值尚未阐明。研究目的:检测临床CRC标本中PEAK1基因及蛋白的表达水平,并初步探讨PEAK1与CRC患者临床病理参数之间的相关性;检测人源性CRC细胞株中PEAK1的表达水平,选择合适细胞株后,使用慢病毒载体构建PEAK1稳定过表达及敲除细胞系;体外验证PEAK1在CRC细胞增殖、迁移侵袭及EMT进程中的生物学角色;体内小鼠荷瘤和转移模型进一步探索PEAK1在CRC生长、血管形成及远处转移中的作用;揭示PEAK1调控CRC生长、转移的关键分子信号及潜在的靶基因,并初步分析PEAK1蛋白关键位点与这些分子的关联性。研究方法:1.分析CRC组织中PEAK1表达水平和临床病理参数之间的相关性收集东南大学附属中大医院消化内科和遵义医科大学附属医院肛肠外科手术切除的27对冰冻CRC组织和124例石蜡包被CRC组织标本(其中84例为癌组织,40例为癌旁正常组织);q RT-PCR和Western blot分别检测配对冰冻组织中PEAK1 mRNA和蛋白的表达;免疫组织化学染色分析石蜡包埋组织中PEAK1蛋白的表达情况,并统计分析PEAK1表达与患者临床病理参数之间的意义。2.构建PEAK1稳定过表达及敲除CRC细胞系q RT-PCR和Western blot分别检测多株人源性CRC细胞系中PEAK mRNA和蛋白表达,选择合适的细胞株进行后期实验;使用PEAK1过表达慢病毒颗粒构建PEAK1稳定过表达的LoVo细胞株(LoVo-PEAK1)、HCT116细胞株(HCT116-PEAK1)及其对照组细胞株(LoVo-Ctrl,HCT116-Ctrl),并用q RT-PCR和Western blot验证PEAK1的表达;使用PEAK1敲除慢病毒颗粒构建PEAK1稳定敲除的SW480细胞株(SW480-KO)、HT29细胞株(HT29-KO)及其对照组细胞株(SW480-Ctrl,HT29-Ctrl),并用q RT-PCR和Western blot验证PEAK1的表达。3.检测PEAK1对CRC细胞增殖、迁移侵袭及EMT进程的影响通过CCK-8和克隆形成实验分别检测PEAK1表达对各组CRC细胞增殖活力、克隆形成能力的影响;划痕和Transwell实验验证PEAK1表达对细胞迁移、侵袭能力的影响;Western blot和细胞免疫荧光染色检测PEAK1表达对各组细胞中EMT相关指标(如上皮标志物E-cadherin和β-catenin,间质标志物N-cadherin和Vimentin)的表达情况。4.分析PEAK1对CRC生长、血管形成及远处转移的影响裸鼠皮下荷瘤实验验证PEAK1表达对CRC细胞生长、成瘤能力及血管形成的影响;尾静脉注射构建体内转移模型检测PEAK1表达对CRC细胞体内侵袭转移、形成转移灶能力的影响。5.揭示PEAK1调控CRC生长、转移的关键信号通路及潜在靶基因使用bulk RAN-seq分析探索PEAK1可能调控的靶基因,并在CRC细胞株和临床标本中验证它们内源性表达的相关性;KEGG信号通路初步分析PEAK1影响CRC生长、转移的关键分子信号通路,并用Western blot进一步验证;运用点突变技术分析PEAK1蛋白上关键位点是否参与这些信号通路和靶基因的调控。6.探索靶基因是否可以重塑PEAK1诱导的CRC细胞生物学功能及信号转导在PEAK1稳定过表达或敲除CRC细胞株中,上调或下调靶基因的表达后,验证PEAK1调控的信号途径及细胞生物学功能是否得到拯救;最后使用小分子拮抗剂抑制关键信号通路传导,进一步验证是否可以扭转PEAK1表达异常而诱导的CRC细胞生长、转移能力。研究结果:1.在27对配对冰冻CRC组织中,PEAK1基因和蛋白表达水平在癌症组织中均显著下调;免疫组织化学染色结果进一步显示,相对于癌旁正常组织,肿瘤组织中PEAK1蛋白表达明显受损,且PEAK1表达下调与肿瘤大小、分化等级、淋巴结转移、远处转移及临床分期密切相关(P<0.05)。2.高转移人源CRC细胞株,如HCT116、LoVo低表达PEAK1 mRNA和蛋白,而原位癌细胞株,如SW480、HT29高表达PEAK1 mRNA和蛋白;并成功构建PEAK1稳定过表达的LoVo、HCT116细胞系,和PEAK1稳定敲除的SW480、HT29细胞系。3.在LoVo、HCT116细胞系中过表达PEAK1后,细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力明显下调;相反,在SW480、HT29细胞系中敲除PEAK1后,细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力显著增强;进一步研究表明,LoVo、HCT116细胞系中过表达PEAK1后,上皮标志物E-cadherin和β-catenin表达明显上调,而间质标志物N-cadherin和Vimentin显著下调,SW480、HT29稳定敲除PEAK1细胞系则呈现完全相反的结果。4.体内荷瘤模型表明,PEAK1过表达明显抑制肿瘤体积、生长速度、癌细胞增殖活性及血管形成能力;体内转移模型显示,PEAK1过表达后,肝转移率和转移灶数量显著下调。5.测序结果表明,27个显著差异表达的基因可能为PEAK1调控的靶点;进一步研究表明,内源性PPP1R12B与PEAK1的表达呈正相关关系,且PEAK1可明显上调PPP1R12B表达;PEAK1-PPP1R12B轴通过负调控Grb2/PI3K/Akt信号通路,进而抑制CRC恶性进程;PEAK1蛋白可能部分通过Y1188位点,而不是P1153位点,对CRC的生长、转移及Grb2/PI3K/Akt信号进行调控。6.在PEAK1稳定过表达的LoVo、HCT116细胞系中敲减PPP1R12B表达后,细胞增殖、迁移、侵袭能力及Grb2/PI3K/Akt信号通路的活性明显恢复;在PEAK1稳定敲除的SW480、HT29细胞系中上调PPP1R12B后,细胞增殖、迁移、侵袭能力及Grb2/PI3K/Akt信号通路的活性显著受损;在PEAK1稳定敲除的SW480、HT29细胞系中,使用PI3K/Akt信号通路的小分子拮抗剂后,细胞增殖、迁移及侵袭能力明显下调。研究结论:1.CRC组织中PEAK1基因和蛋白表达水平均下调,并与CRC生长、转移及临床等级密切相关。2.体内外实验均表明,PEAK1表达抑制CRC细胞增殖、侵袭及转移能力。3.PEAK1与PPP1R12B形成正反馈轴,负调控Grb2/PI3K/Akt信号通路,进而抑制CRC生长和转移。4.PEAK1调节CRC细胞生物学功能和Grb2/PI3K/Akt信号,部分通过蛋白上Y1188位点实现。5.通过改变PPP1R12B表达量,可重塑PEAK1对CRC细胞增殖、迁移、侵袭能力及Grb/PI3K/Akt信号转导的负调控角色。