论文部分内容阅读
背景
阿尔茨海默病（Alzheimersdisease,AD）是目前医学上疑难疾病之一，现有针对阿尔茨海默病治疗方面的研究，大多数以失败告终，主要原因在于对其发病机制认识的深度不足。在治疗靶点方面，β-淀粉样蛋白（Amyloidβ-protein，Aβ）是研究较多的治疗靶点之一，很多研究主要围绕Aβ蛋白的前体蛋白展开，而对Aβ神经毒性方面的研究较少，中医药类的更少。四妙勇安汤是古方之一，在古代文献中记载具有治疗脱疽的作用，在现代动物实验中发现其具有减少ApoE小鼠主动脉斑块面积的作用[1]，加味四妙勇安汤是在四妙勇安汤的基础上添加清热解毒药物虎杖等，这两种药物在阿尔茨海默病方面的研究均无文献提及。因此，本研究通过Aβ25-35蛋白诱导海马HT22细胞损伤模型，观察加味四妙勇安汤与加味四妙勇安汤对细胞模型的神经保护作用。
目的
1.观察Aβ25-35对海马HT22细胞在形态学、细胞存活率、乳酸脱氢酶释放量及氧化指标上的影响。
2.通过观察加味四妙勇安汤含药血清与四妙勇安汤含药血清对Aβ25-35损伤的HT22细胞，在在形态学、细胞存活率、乳酸脱氢酶释放量及氧化指标上是否有影响，来探讨两种药的含药血清是否具有减少Aβ25-35造成的HT22细胞损伤的作用。
方法
1.制备血清。
将大鼠分为3组，分别灌胃加味四妙勇安汤(以下简称“加味四妙”)、四妙勇安汤（以下简称“四妙”）与正常饮用水，灌胃7次后，腹主动脉取血，分离出血清，灭活、过滤，分装保存。
2.确定含药血清浓度。
将含药血清、空白血清和Neu培养基，按0%、2.5%、5%、10%、20%、40%的浓度梯度配比，分为6组，培养细胞24h后，做MTT毒性实验，确定含药血清安全浓度。将确定浓度的含药血清与同浓度的空白血清，分别加入细胞中，培养24h后，做MTT实验，确定该实验所需的加味四妙血清与四妙血清浓度。
3.确定Aβ25-35造模浓度。
将HT22海马神经元细胞，分为6组，其中空白组加入基础培养基，其他各组分别加入终浓度为2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的Aβ25-35蛋白，培养24h后，做MTT实验，确定Aβ25-35造模浓度。
4.检测MTT细胞毒性实验与乳酸脱氢酶释放实验结果。
根据上述确定的血清浓度及Aβ25-35造模浓度作为实验条件，将细胞分为四组，空白血清组、模型组、模型加加味四妙血清组及模型加四妙血清组，培养24h后，随即进行MTT毒性实验与乳酸脱氢酶释放实验。
5.观察细胞形态变化。
在20倍显微镜下观察四组细胞的形态变化。
6.观察细胞内的活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）变化。
用ROS探针，观察各组细胞内活性氧水平。
7.检测细胞上清液的氧化指标超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平。
参照试剂盒说明书测定各组细胞上清液内超氧化物氧化酶、丙二醛的水平。
结果
1.确定含药血清浓度。
通过MTT实验结果发现，2.5%的加味血清与2.5%的四妙血清与2.5%的空白血清，对细胞存活率没有明显差异，该实验选择用2.5%的浓度作为干预细胞的血清浓度。
2.确定Aβ25-35造模浓度
当Aβ25-35浓度在40μmol/L时，细胞存活率明显下降，因此该实验选择40μmol/L为细胞的造模浓度。
3.检测MTT细胞毒性实验与乳酸脱氢酶LDH释放实验结果。
实验结果显示，在MTT细胞毒性实验中，四组细胞的OD值没有统计学差异，在乳酸脱氢酶释放实验中，模型组较空白血清组，LDH释放量的OD值明显升高（P＜0.05），具有统计学意义；加味四妙血清组，与四妙血清组相对于模型组，LDH释放量的OD值，显著降低（P＜0.05），具有统计学意义，其中2.5%的加味四妙血清组OD值降低幅度大于2.5%的四妙血清组。
4.细胞形态观察的结果。
实验结果显示，空白组海马神经元细胞为正常形态，模型组细胞形态紊乱。在两个含药血清组细胞中，正常形态的细胞数量较模型组均增多。而加味四妙血清组及四妙血清组，两组血清形态学上没有明显差异。
5.细胞内活性氧变化结果。
实验结果显示，在空白血清组、模型组、加味四妙血清组，细胞内ROS水平生成均升高，而四妙血清组细胞内ROS水平较前三组明显减少（P＜0.05）。
6.SOD与MDA的结果
实验结果表明，四组细胞内SOD水平没有显著性差异；加味四妙血清组较模型组的MDA值明显下降（P＜0.05），其他各组间均无明显差异。
结论
加味四妙勇安汤含药血清与四妙勇安汤含药血清对Aβ25-35所致的细胞损伤均具有一定的保护作用，两组药均可以改善细胞形态，减少细胞膜损伤，其中加味四妙勇安汤含药血清可以减少氧化产物MDA的生成，四妙勇安汤含药血清可以减少细胞内ROS的产生。
阿尔茨海默病（Alzheimersdisease,AD）是目前医学上疑难疾病之一，现有针对阿尔茨海默病治疗方面的研究，大多数以失败告终，主要原因在于对其发病机制认识的深度不足。在治疗靶点方面，β-淀粉样蛋白（Amyloidβ-protein，Aβ）是研究较多的治疗靶点之一，很多研究主要围绕Aβ蛋白的前体蛋白展开，而对Aβ神经毒性方面的研究较少，中医药类的更少。四妙勇安汤是古方之一，在古代文献中记载具有治疗脱疽的作用，在现代动物实验中发现其具有减少ApoE小鼠主动脉斑块面积的作用[1]，加味四妙勇安汤是在四妙勇安汤的基础上添加清热解毒药物虎杖等，这两种药物在阿尔茨海默病方面的研究均无文献提及。因此，本研究通过Aβ25-35蛋白诱导海马HT22细胞损伤模型，观察加味四妙勇安汤与加味四妙勇安汤对细胞模型的神经保护作用。
目的
1.观察Aβ25-35对海马HT22细胞在形态学、细胞存活率、乳酸脱氢酶释放量及氧化指标上的影响。
2.通过观察加味四妙勇安汤含药血清与四妙勇安汤含药血清对Aβ25-35损伤的HT22细胞，在在形态学、细胞存活率、乳酸脱氢酶释放量及氧化指标上是否有影响，来探讨两种药的含药血清是否具有减少Aβ25-35造成的HT22细胞损伤的作用。
方法
1.制备血清。
将大鼠分为3组，分别灌胃加味四妙勇安汤(以下简称“加味四妙”)、四妙勇安汤（以下简称“四妙”）与正常饮用水，灌胃7次后，腹主动脉取血，分离出血清，灭活、过滤，分装保存。
2.确定含药血清浓度。
将含药血清、空白血清和Neu培养基，按0%、2.5%、5%、10%、20%、40%的浓度梯度配比，分为6组，培养细胞24h后，做MTT毒性实验，确定含药血清安全浓度。将确定浓度的含药血清与同浓度的空白血清，分别加入细胞中，培养24h后，做MTT实验，确定该实验所需的加味四妙血清与四妙血清浓度。
3.确定Aβ25-35造模浓度。
将HT22海马神经元细胞，分为6组，其中空白组加入基础培养基，其他各组分别加入终浓度为2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的Aβ25-35蛋白，培养24h后，做MTT实验，确定Aβ25-35造模浓度。
4.检测MTT细胞毒性实验与乳酸脱氢酶释放实验结果。
根据上述确定的血清浓度及Aβ25-35造模浓度作为实验条件，将细胞分为四组，空白血清组、模型组、模型加加味四妙血清组及模型加四妙血清组，培养24h后，随即进行MTT毒性实验与乳酸脱氢酶释放实验。
5.观察细胞形态变化。
在20倍显微镜下观察四组细胞的形态变化。
6.观察细胞内的活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）变化。
用ROS探针，观察各组细胞内活性氧水平。
7.检测细胞上清液的氧化指标超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平。
参照试剂盒说明书测定各组细胞上清液内超氧化物氧化酶、丙二醛的水平。
结果
1.确定含药血清浓度。
通过MTT实验结果发现，2.5%的加味血清与2.5%的四妙血清与2.5%的空白血清，对细胞存活率没有明显差异，该实验选择用2.5%的浓度作为干预细胞的血清浓度。
2.确定Aβ25-35造模浓度
当Aβ25-35浓度在40μmol/L时，细胞存活率明显下降，因此该实验选择40μmol/L为细胞的造模浓度。
3.检测MTT细胞毒性实验与乳酸脱氢酶LDH释放实验结果。
实验结果显示，在MTT细胞毒性实验中，四组细胞的OD值没有统计学差异，在乳酸脱氢酶释放实验中，模型组较空白血清组，LDH释放量的OD值明显升高（P＜0.05），具有统计学意义；加味四妙血清组，与四妙血清组相对于模型组，LDH释放量的OD值，显著降低（P＜0.05），具有统计学意义，其中2.5%的加味四妙血清组OD值降低幅度大于2.5%的四妙血清组。
4.细胞形态观察的结果。
实验结果显示，空白组海马神经元细胞为正常形态，模型组细胞形态紊乱。在两个含药血清组细胞中，正常形态的细胞数量较模型组均增多。而加味四妙血清组及四妙血清组，两组血清形态学上没有明显差异。
5.细胞内活性氧变化结果。
实验结果显示，在空白血清组、模型组、加味四妙血清组，细胞内ROS水平生成均升高，而四妙血清组细胞内ROS水平较前三组明显减少（P＜0.05）。
6.SOD与MDA的结果
实验结果表明，四组细胞内SOD水平没有显著性差异；加味四妙血清组较模型组的MDA值明显下降（P＜0.05），其他各组间均无明显差异。
结论
加味四妙勇安汤含药血清与四妙勇安汤含药血清对Aβ25-35所致的细胞损伤均具有一定的保护作用，两组药均可以改善细胞形态，减少细胞膜损伤，其中加味四妙勇安汤含药血清可以减少氧化产物MDA的生成，四妙勇安汤含药血清可以减少细胞内ROS的产生。