鸡球虫病是威胁家禽健康和福利最严重的疾病之一,给全世界养鸡业带来巨大经济损失。由于球虫体外培养及基因操作等技术难题造成致病机制研究困难,球虫病的防控研究进展缓慢。棒状体蛋白是重要的毒力因子,在与宿主互作中起重要作用,但对球虫棒状体蛋白的研究却很少。EtROP30在所有预测为棒状体蛋白中唯一同时具有分泌信号肽和核定位序列,可能是分泌蛋白且进入宿主细胞核,发挥调控宿主细胞的作用。EtROP35在子孢子和裂殖子转录组学分析中是棒状体蛋白中转录水平最高的,可能具有重要功能。本研究对柔嫩艾美尓球虫棒状体蛋白EtROP30和EtROP35进行了鉴定及功能研究,并从蛋白与宿主细胞互作等方面对其作用机制进行了探索。一、EtROP30的鉴定及功能EtROP30基因序列全长1578 bp,编码525 aa,理论分子量为56.69 KD。序列分析其含有一个18 aa的N-端分泌信号肽,一个蛋白激酶结构域（175～510 aa）和一个C末端的核定位信号序列（516～525 aa）,在28个棒状体蛋白中唯一同时含有分泌信号肽和核定位序列。包含8个艾美尓球虫棒状体蛋白Ⅰ亚家族（ROPK-Eten1）的基序（LGAGGTAV、EFAVKM、TER、CHADIKPENF、ADFGM、MDPSH、YDAWS、KRPTP）和蛋白激酶催化所需的3个关键残基(K211、D360、D378)。EtROP30的定位与棒状体蛋白的定位特征一致,子孢子的分泌试验表明EtROP30是分泌蛋白。其序列特征、定位和分泌特性表明EtROP30属于棒状体蛋白。EtROP30能转运至DF-1细胞核,且入核是通过核定位信号序列介导的。EtROP30在球虫不同发育阶段的转录和蛋白表达相对水平趋势相似,在子孢子和裂殖子中显著高于未孢子化卵囊和孢子化卵囊,在裂殖子阶段最高。粘附和入侵阻断试验发现,EtROP30在体外具有一定的粘附宿主细胞功能,不在子孢子入侵宿主细胞的过程中起作用。为了探索EtROP30对寄生虫毒力的意义,本研究通过CRISPR/Cas9系统构建了表达EtROP30的弓形虫RHΔKu80-EtROP30,发现该蛋白显著促进弓形虫胞内增殖,显著增强对小鼠的致病力,弓形虫是顶复门原虫的模式生物,因此推测EtROP30是柔嫩艾美尔球虫的毒力因子。RHΔKu80-EtROP30感染细胞较RHΔKu80显著上调细胞内对寄生虫胞内发育至关重要c FOS基因表达,EtROP30增强寄生虫毒力可能因为对细胞c FOS的调控。二、EtROP30与宿主细胞互作蛋白的筛选、验证及功能为探索EtROP30对细胞的调控,及与宿主的互作关系,本研究进行了过表达EtROP30细胞转录组学分析、互作蛋白的筛选、验证和功能探索。转录组学检测到差异表达基因927个,其中上调292个,下调635个,其中包括与寄生虫感染密切相关的FOS、EGR1、CTGF等基因显著上调,I型干扰素表达显著下调。GO功能富集分析显示差异基因主要与STAT蛋白苏氨酸磷酸化、I型干扰素相关的信号途径和相关应答、免疫应答通路、细胞受体调节等相关。为筛选宿主与EtROP30互作的蛋白,进行了免疫共沉淀后SDS-PAGE蛋白胶银染,筛选差异条带质谱鉴定,两条差异条带分别鉴定出169种和167种蛋白,综合转录组学和蛋白功能分析,进一步选择了22种蛋白进行了酵母双杂交试验一一验证,发现EtROP30与其中18种蛋白不存在互作关系,与4种蛋白存在互作（P53、STK26、TRIM68、HSPA14）。对这4种蛋白进行细胞内共定位和免疫共沉淀验证,排除了EtROP30与STK26的互作,对剩余的3种蛋白进行GST pull-down验证,GST pull-down反映蛋白的直接互作关系,发现EtROP30与P53不存在直接互作,与TRIM68、HSPA14存在蛋白直接互作关系。为了研究EtROP30与TRIM68、HSPA14互作区域,将EtROP30分为三段:19～174 aa、175～510 aa（激酶结构域）、511～525 aa,分别与TRIM68、HSPA14进行酵母双杂交试验。结果表明,三段均不与TRIM68互作,EtROP30与HSPA14互作的区域为175～510 aa的激酶结构域,互作是否与激酶活性有关,有待进一步研究。si RNA干扰HSPA14后过表达EtROP30试验发现,EtROP30转染细胞后诱导细胞凋亡,下调细胞HSPA14后转染EtROP30,诱导细胞凋亡率显著降低,表明EtROP30诱导细胞凋亡的机制是通过与细胞内HSPA14互作,该机制的具体路径及是否存在其他方式需进一步研究。三、EtROP35的鉴定及功能EtROP35基因序列全长1467 bp,编码488 aa,理论分子量为52.8 KD。序列分析其含有一个25 aa的N-端分泌信号肽和一个蛋白激酶结构域（197～460 aa）,包含8个ROP35亚家族的基序（KPRARLaa、GIVIKG、KEV、VHRDIKGCNY、ADFEG、IAPEL、TDVYA、NRYDI）和蛋白激酶催化所需的3个关键残基(K253、D344、D362)。EtROP35的定位特征与棒状体蛋白的定位一致,子孢子的分泌试验表明EtROP35是分泌蛋白。其序列特征、定位和分泌特性表明EtROP35属于棒状体蛋白。EtROP35在子孢子和裂殖子中的表达水平显著高于孢子化卵囊,在裂殖子阶段最高。粘附和入侵阻断试验发现,EtROP35在体外具有显著粘附宿主细胞的功能,多抗具有显著的阻断子孢子入侵宿主细胞的作用。通过免疫共沉淀联合质谱对EtROP35与宿主细胞互作的蛋白进行了筛选,验证和功能有待进一步研究。四、EtROP30及EtROP35免疫保护评价本研究评估了EtROP30和EtROP35的抗原性及重组蛋白疫苗的免疫保护效果,发现EtROP30和EtROP35均是球虫的天然抗原,可以刺激机体产生高水平Ig Y。作为重组蛋白疫苗,EtROP30和EtROP35免疫保护评价试验表明,免疫攻虫组的平均增重率为75.74%和85.20%,显著高于不免疫攻虫对照组（52.33%）;平均病变计分1.66±0.14和1.56±0.21,显著低于对照组（2.48±0.21）;卵囊排出减少达61.42%和52.81%,抗球虫指数分别为149.32和159.6,效果均判断为中等有效。综上所述,本研究对EtROP30和EtROP35进行了鉴定和功能研究,表明EtROP30和EtROP35是E.tenella的棒状体蛋白,且EtROP30是球虫的毒力因子,具有一定的体外粘附功能,EtROP35在粘附和入侵方面均具有一定作用。通过转录组学分析了EtROP30对细胞的调控,免疫共沉淀联合质谱筛选了与其互作的宿主蛋白,经多种方法对互作蛋白进行了验证,还发现EtROP30与HSPA14互作调控细胞凋亡。EtROP30和EtROP35是球虫的天然抗原,重组蛋白疫苗能诱导中等有效的抗球虫效果。本研究为筛选球虫的关键致病因子及解析球虫的致病机制和防控研究提供参考。