猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus,APPV)是黄病毒科、瘟病毒属成员,是造成AⅡ型先天性震颤的主要病原之一,其能引发感染仔猪全身肌肉震颤或者后肢无法站立的情况,造成初生仔猪因为无法吮乳而死亡,给养猪业造成了巨大的损失。由于该病属于新发疾病,目前还没有针对该病的特异性疫苗面世,而对病原致病机制的掌握,是能够科学制定防控措施的关键,使切断其传播途径及控制感染源成为可能。本研究获得了流行毒株CHN-SC的全基因序列,并通过分子生物学软件分析其与其他参考毒株在核苷酸水平上的差异;通过建立荧光定量RT-PCR方法及制作病理组织切片,对感染仔猪进行病理损伤机制的研究;并通过对感染仔猪和对照组进行转录水平的差异研究,探索APPV的致病机制。1.APPV CHN-SC株的全基因测序与分析采取四川遂宁某规模化养殖场内APPV疑似感染仔猪的各组织及血清,处理后进行RT-PCR检测,证实为阳性感染后,设计、合成12对引物,通过克隆、测序、拼接等步骤,获得四川地区APPV流行毒株CHN-SC的全基因序列全长11303bp;并进一步通过Editseq和Megalign软件分析CHN-SC病毒株与APPV参考毒株之间的同源性。结果显示与参考株对比,同源性在81.7%~90.6%之间,其中,与来源于德国的APPV-GER01毒株同源性最高,为90.6%,与中国广东的两株APPV毒株同源性最低,均为81.7%。2.APPV感染仔猪的病理损伤的研究本实验首先针对APPV NS2基因建立了荧光定量RT-PCR检测方法,并利用此方法测得APPV在患病仔猪的中枢神经系统及外周淋巴器官中载量最高。并且,在排除了其余CT相关病原干扰后,对各组织器官进行病理学观察,结果显示,主要的和最严重的病变均集中在中枢神经系统。相对于对照组,实验组可观察到明显的神经元收缩,核深染,脑膜水肿,核颗粒层坏死且伴有核碎片,细胞染色质溶解,神经细胞坏死等严重的病理变化,提示APPV可能主要在淋巴器官中进行复制,主要感染中枢神经系统。3.APPV自然感染仔猪小脑组织的转录差异差异分析将上述排除其余CT病原干扰的感染仔猪,采取其小脑组织,采用Illumina Hiseq4000平台进行转录组测序,设健康仔猪小脑组织为对照组,构建两个cDNA文库:APPV感染小脑组织文库、健康小脑组织文库.本次测序一共筛选到381个差异表达的基因,其中显著上调的有163个,显著下调的有218个,筛选标准为P<=0.05,|log2(FC)|>=0.263。对差异基因通过GO富集分析,具有明显比例差异的二级功能类包括β-淀粉样蛋白清除的负调节(negative regulation of amyloid-beta clearance)、信号调节(regulation of signaling)、活化素受体信号通路(activin receptor signaling pathway)、激素分泌(hormone secretion)、细胞通讯调节(regulation of cell communication)、信号转导调控(regulation of signal transduction)、内涵体(endosome)、细胞内部(intracellular)、空泡(vacuole)、髓鞘(myelin)等。利用KEGG对差异基因进行注释,结果显示在小脑组织中差异表达的基因主要富集于甘油酯代谢(Glycerolipid metabolism)、神经营养因子信号通路(Neurotrophin signaling pathway)、长期抑郁症(Long-term depression)、突触囊泡循环(Synaptic Vesicle Cycle)、轴突指导(Axon guidance)、黏附斑信号通路(Focal adhesion)、癌细胞相关信号通路(Pathways in cancer)、Hippo信号通路(Hippo signaling pathway)、肾素分泌(Renin secretion)、癌症中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)等。