背景:环境应激是造成个体心理紧张的各种应激源对个体行为的影响,不同的环境刺激会引起不同的应激反应,主要表现在生理、心理、行为和社会方面的变化。研究表明环境应激能够诱发表观遗传修饰的改变,调控基因表达,进而影响抑郁症等疾病的病理进程。表观遗传调控是指在基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,通过一系列化学修饰影响基因表达的调控机制。表观遗传修饰主要包括DNA/RNA修饰、染色质结构修饰、组蛋白修饰等。既往研究发现DNA/RNA的甲基化在应激及抑郁症发生中起着重要的作用,而去甲基化修饰可能起着同样重要的作用,但机制不清。Tet 酶（Ten-eleven translocation enzymes,Tetenzymes）是一种双加氧酶,通过将5-甲基胞嘧啶（5-methyldeoxycytosine,5mC）氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine,5hmC）来促进DNA/RNA去甲基化。目前研究发现RNA上也存在5hmC修饰,可以参与调控RNA的稳定性、定位和翻译,具体调控机制不清。课题组前期研究发现慢性温和应激（chronicmildstress,CMS）条件下小鼠海马脑区Tet2表达增多,细胞内Tet2的分布异常,细胞质中Tet2表达增多,增多的Tet2如何调控RNA的稳定性将是本研究的主要研究内容。方法:建立慢性温和应激抑郁小鼠模型,利用悬尾实验（tail suspension test,TST）、强迫游泳实验（forced swimming test,FST）、糖水偏好实验（sucrose preference test,SPT）检测行为学;通过Dot blot方法检测RNA 5hmC的修饰改变;通过Western blot检测蛋白表达水平;通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）实验结合蛋白质谱分析筛选Tet2结合蛋白;通过对Tet2和互作蛋白的RNA免疫共沉淀结果进行交集、聚类分析,筛选出参与轴突导向、神经发育的靶基因;通过qRT-PCR检测所筛选靶基因的表达。结果:本研究首先检测了应激条件下RNA 5hmC的变化,结果显示慢性温和应激小鼠抑郁相关脑区海马和前额叶皮层脑区 RNA 5hmC修饰增加。为了探究RNA 5hmC修饰增加的原因,检测了与5hmC修饰相关催化酶Tet蛋白变化。结果显示在慢性温和应激小鼠海马脑区 Tet2蛋白在mRNA水平和蛋白水平表达均增加,而Tet1和Tet3表达却减少,这表明慢性温和应激条件下,RNA5hmC修饰增加主要是由Tet2表达显著增加引起的。为了进一步证实Tet2是调控RNA5hmC修饰增加的主要蛋白,在N2a细胞上敲减Tet2或者过表达Tet2催化结构域（Tet2 catalytic domain,Tet2 CD）,结果发现在N2a细胞上敲减Tet2后RNA 5hmC修饰减少,过表达Tet2 CD后RNA5hmC修饰增加。为了进一步研究Tet2介导的RNA 5hmC修饰增加在应激条件下的作用,通过利用Tet2抗体进行免疫沉淀实验,结合质谱数据分析,筛选出肽段丰度较高的蛋白Upf1（The ATP-dependent RNA helicase upstream frameshift 1）。利用免疫共沉淀产物证实了 Tet2与Upf1存在相互作用。随后对Tet2的RNA免疫共沉淀和Upf1的RNA免疫共沉淀的数据进行分析,筛选出共同通路如参与轴突导向和神经发育的mRNA:Ntn1、Unc5b、Ptpn11及Src。qRT-PCR实验证实在应激条件下这些mRNA表达均减少。在N2a细胞上分别敲减Tet2和Upf1,发现Unc5b mRNA的改变最为显著。为证实Tet2-Upf1复合物是否参与mRNA的稳定性调控,进一步研究了 Tet2-Upf1复合物与下游基因Unc5b mRNA的稳定性的关系。在N2a细胞上敲减Tet2或Upf1,结果表明增加了 Unc5b mRNA的稳定性;而过表达Tet2CD或Upf1,结果表明降低了 Unc5bmRNA的稳定性。另外,在过表达Upf1同时敲减Tet2也增加了 Unc5b mRNA的稳定性。这些结果表明Tet2-Upf1复合物参与mRNA稳定性调控。结论:慢性温和应激条件下,Tet2表达增加能够引起RNA 5hmC修饰增加。Tet2可以与Upf1相互作用影响RNA 5hmC修饰参与应激相关下游基因如Unc5b mRNA的稳定性调控。该研究揭示了 RNA表观修饰参与了应激及抑郁发生的机制,可以作为治疗的靶点。