先天性气管软化塌陷、狭窄或闭锁,后天因外伤、肿瘤、大面积烧伤等原因引起的气管损伤均会引起严重的呼吸困难甚至窒息。切除病变气管并行端-端吻合被普遍认为是最有效的治疗手段。然而当所需切除的气管长度超过成人的1/2或婴幼儿的1/3时,由于张力等原因无法行端-端吻合,而需行气管替代治疗。随着气管重建研究的深入,组织工程气管的出现为气管重建带来了曙光。组织工程将种子细胞、支架材料和细胞因子有效结合,从而修复相关组织缺损,进行器官重建。支架材料作为组织工程气管的主要框架结构、种子细胞生长的土壤,是成功构建组织工程气管的基础。目前组织工程气管支架材料使用较多的是同种异体气管基质材料以及合成材料,本实验主要研究脱细胞气管基质材料及3D 打印材料。本研究旨在通过体外实验对比3D 打印气管支架与脱细胞气管基质材料生物力学性能、生物相容性等方面的各自优势;通过体内埋植实验,评估两种材料的生物相容性、以及受体的免疫排斥反应及炎症反应;最后通过气管缺损修复实验,评估移植后效果以及存在的不足之处。最终通过上述对比研究得出两种材料的优缺点,为构建更为合理有效的组织工程气管提供依据。第一部分 两种基质材料生物力学性能、生物相容性体外对比实验目 的评价3D打印气管材料与脱细胞气管基质材料生物力学性能、生物相容性方面的各自优势。方 法1.利用3D 打印技术制备PCL多孔气管支架后通过溶胶凝胶法获取纳米二氧化硅修饰后的气管支架材料;2.利用去污剂联合酶法制备脱细胞兔气管基质材料;3.采用纵向拉伸、径向压缩和三点弯曲试验评价两组支架材料的生物力学性能;4.通过CCK-8、扫描电镜、Giemsa实验及接触实验检测两组支架与细胞共培养后细胞的增殖黏附性能以及细胞毒性情况。结 果1.3D打印PCL气管支架生物力学性能优于脱细胞气管支架;2.扫描电镜提示细胞在两组支架表面均粘附良好,Giemsa显示脱细胞气管细胞毒性更小,CCK-8检测提示脱细胞气管支架更有利于细胞增殖。结 论1.3D打印PCL气管支架具有良好的生物力学性能;2.两组支架均有利于细胞粘附,脱细胞气管支架具有更优的细胞增殖环境,更低的细胞毒性。第二部分 体内埋植实验目 的评价两种材料的生物相容性、免疫排斥反应及炎症反应。方 法1.将两组气管支架埋植于受体皮下;2.动态监测受体体内血常规和血清免疫球蛋白的变化;3.对埋植物行组织学分析;4.免疫组织化学染色检测埋植物CD68及MHC-I、II抗原的表达量。结 果1.实验动物的白细胞在术后一周左右达到高峰,随后消退;IgM峰值出现早于IgG,符合体液免疫应答抗体产生的规律。在炎症急性期3D打印PCL气管支架组监测指标均高于脱细胞气管支架组,急性期后两组指标水平相似;2.HE染色显示3D打印PCL气管组炎症的反应以嗜酸性粒细胞浸润为主,而脱细胞气管支架组炎症细胞浸润较少;3.免疫组化检查显示两组支架巨噬细胞浸润均不明显。结 论1.脱细胞气管支架对受体炎症反应刺激小;2.3D打印PCL气管支架组与脱细胞气管支架组对受体免疫排斥反应均较小。第三部分 气管缺损修复实验目 的评估两组气管支架补片修复气管缺损后后效果以及存在的不足之处。方 法1.将受体气管缺损处分别使用两组气管补片修复移植;2.修复后定期行气管镜检查、吸痰;3.收获后对修复处组织行组织学分析;4.免疫组织化学染色检测获取组织CK-18抗体情况。结 果1.新鲜气管补片组因急性炎症排斥反应、脱细胞气管补片组因气管塌陷等原因均在短期内窒息死亡,3D 打印PCL气管支架补片组受体经定期吸痰、抗感染等治疗后一直生存至收获移植物;2.移植30d后通过纤支镜检查可以看到吻合口愈合、通畅,未见明显肉芽组织,并且已经上皮化,远端管腔通畅未见明显狭窄、分泌物;3.术后30天后将移植物取出HE染色显示,支架表面可见新生纤毛,PCL材料结构完整,纤毛下方组织结构紊乱,可见炎性细胞浸润:4.免疫组化CK-18抗体检测显示,移植物表面上皮再生,纤毛结构排列较整齐,可见少量腺体再生。结 论1.脱细胞气管补片行气管缺损修复实验效果不理想;2.3D打印PCL气管支架补片原位移植30d后,吻合口完全愈合、管腔完全通畅,补片表面上皮化,具有一定原生气管功能。