长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于或等于200bp且不编码蛋白质的RNA,早先的研究中被认为是基因表达中的“噪音”,但随着人类基因组计划的完成,研究者逐渐加深了对与lncRNA的认识,越来越多的在生命活动中有着重要功能的lncRNA被发现及研究,针对lncRNA的研究也逐渐变多。lncRNA在不同的物种中的进化保守性较低,具有较大的物种差异性,在生命体中的大部分组织和器官中均有表达,但不同的组织和器官的转录水平存在较大的差异性。在目前的lncRNA的研究中发现,lncRNA在生命体的许多重要生命活动以及一些疾病的发生发展均发挥着重要的作用,具体体现在生物体发育、细胞分化、先天免疫、肿瘤的发生与发展等方面。lncRNA在细胞调控中主要参与基因印记、调节细胞周期、转录调控等功能。主要体现在表观遗传学调控、转录调控以及转录后调控三个方面。在目前的lncRNA的研究手段中,除了前期发现预测lncRNA的基因芯片以及转录组分析等生物信息学手段,对于来自基因芯片以及RNA-seq的分析结果仍然需要来自分子生物学实验的验证,常用的验证方法包括Q-PCR、基因敲降、FISH、诺瑟杂交、RIP、RIP-Chip、RIP-seq、CLIP等。草鱼作为我国四大家鱼之一,草鱼养殖在我国的淡水鱼养殖中约占20%的比例,是我国农业经济的重要组成部分。目前草鱼的养殖在全国各地均有不同规模的开展,随着养殖规模的扩大,养殖密度的提升,鱼病对于养殖的影响也越来越大,其中影响最大的鱼病当属草鱼出血病。所以针对草鱼出血的免疫机制的研究就显得格外重要,然而有关草鱼免疫相关的lncRNA的研究在我国仍较少,近些发表的草鱼全基因组图谱为开展草鱼lncRNA研究提供了基石。为了研究草鱼与先天免疫相关的lncRNA,我们通过TopHat2软件将转录组数据比对到草鱼基因组上,后使用Cufflinks对TopHat2的结果进行转录本重构,得到新转录本数据。根据草鱼基因组从新转录本中筛选出未被草鱼基因组标记为基因的新转录本作为候选的non-coding RNA。在non-Coding RNA中选出长度大于200bp的转录本作为候选lncRNA,将这些lncRNA通过基于支持向量机算法的CPC软件进行预测,得到最终与抗病毒相关的lncRNA集合。对筛选的到lncRNA CiISG152-L2通过WGCNA软件的方式对其功能进行共表达分析,得到其相关基因的网络,对这些基因进行了功能富集分析发现,其主要的功能集中在免疫功能中。为了验证生物信息学分析的结果,首先克隆出草鱼lncRNA CiISG152-L2以及功能相关的基因CiISG152的全长序列,长度分别为1802bp和1161bp,其中CiISG152基因内包含一个104bp的5’UTR,一个586bp的3’UTR和一个序列长度为471bp的ORF区域,ORF编码一个长度为156aa的多肽链,其多肽链的相对分子质量为17.58 kD,并且克隆了该基因启动子。通过RT-PCR实验,分析了lncRNA CiISG152-L2在草鱼的不同组织内的表达情况,反映出lncRNA的组织差异性,并且分析了lncRNA CiISG152-L2与CiISG152在CIK细胞内表达特征,两者在病毒诱导后出现较为类似的表达量变化。为了分析该lncRNA的功能,通过RNAfold WebServe对得到的RNA序列进行了RNA二级结构分析,得到基于最小自由能以及热力学集合两种不同方法的预测结果,并截断出可能的功能区域。为了分析lncRNA CiISG153-L2与Ci ISG152在转录水平的相关性,在过表达以及干扰该lncRNA后,通过RT-PCR检测得到CiISG152的表达量同步性的出现上调与下降。为了进一步分析该lncRNA对CiISG152的转录调控,通过双荧光素酶报告基因实验,发现该lncRNA可以显著提升CiISG152的启动子活性,并且通过预测的RNA二级结构截断的功能区域,发现提升启动子活性的区域在该lncRNA的620-1190bp的区域。为了进一步探究该lncRNA在先天免疫中的功能,通过免疫共沉淀实验证明了Ci ISG152可以与CiIRF3相互结合,CiIRF3在被CiISG152结合发生ISG化修饰后,可以有效增强CiIRF3在细胞内的表达强度,进而在抗病毒反应中发挥更多的作用。为了验证在鱼类中该lncRNA功能,在过表达与干扰lncRNA CiISG152-L2,通过蛋白定量的方式对抗病毒反应中的CiIRF3进行定量分析,证明在过表达该lncRNA后,CiIRF3在细胞中的蛋白水平明显增强,干扰该lncRNA则相反。综上所述,通过对lncRNA CiISG152-L2在先天免疫中的转录调控研究,反映出该lncRNA在草鱼抗病毒反应中的重要作用。