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香蕉是继水稻、小麦和玉米之后的世界第四大粮食作物。但目前香蕉产业面临着被枯萎病侵染可能导致种族灭绝的严峻考验。尽快培育出具有高产量高品质同时又对枯萎病具有高抗性的香蕉新品种，是解决当前问题最根本的措施。但由于大多数香蕉栽培种属于三倍体，具有高度不育性，难于采用传统的杂交育种方法来进行品种改良。体细胞杂交育种不仅可以实现核DNA重组，也可以实现胞质基因重组，为香蕉种质的遗传改良提供了一条捷径。而香蕉原生质体再生体系的建立是进行体细胞杂交育种的前提条件。
近年来，在国际上，通过原生质体培养途径已经成功获得4个基因型的9个香蕉品种的再生植株，但到目前为止，只有2篇关于香蕉体细胞杂交的研究。本论文以我国主栽的香蕉品种龙牙蕉(Musa AAB Silk cv．Guoshanxiang)和贡蕉[Musa acuminata cv．Mas(AA)]为试材，在研究它们的原生质体培养及植株再生的主要调控因素的基础上，探索了利用PEG(聚乙二醇)融合法进行香蕉原生质体不对称融合及植株再生，以期将贡蕉抗枯萎病生理小种1号的性状转移到龙牙蕉品种中。主要结果如下：
建立了贡蕉原生质体培养及植株再生体系。采用继代7 d的贡蕉胚性细胞悬浮系(Embryogeneic cell suspensions，ECS)在3.5﹪纤维素酶R-10、1﹪离析酶R-10和0.15﹪果胶酶Y-23的酶溶液中酶解8 h可获得最高产量的原生质体(1．2×10<7>个/mL：PCV ECSl，原生质体活力达到85﹪以上。分别以培养基A和B为培养成分在两种培养系统(液体浅层培养和看护培养)中进行原生质体培养。结果表明：在液体浅层培养系统中，培养基B比培养基A更适合香蕉原生质体的培养。培养基B的成分以M2培养基为基本培养基，为提高培养基的渗透压添加蔗糖、葡萄糖；培养基A成分为N6盐，。KM维生素，有机酸，糖醇，Morel维生素，1.9 mM KH<,2>PO<,4>，0.5 mM MES，0.9 pM 2,4-D，5.4μM NAA，2.3μM ZT，117 mM蔗糖，0．4．M葡萄糖。在液体浅层培养系统中，获得的培养物为只能增殖而不能进一步发育的非胚性细胞团；在看护培养系统获得获得的培养物为胚性细胞团(protoplast-derived cell colonies，PDCC)，它们可通过体细胞胚胎发生途径再生植株。TDZ对PDCC的体胚形成具有强烈的促进作用。当TDZ浓度为0.4μM时，体胚形成频率最高(7.9×10<3>个体胚/mL PCV PDCC)，分别是4.4μM BAP所诱导的体胚形成频率的4倍，是0.8μM ZT所诱导的体胚形成频率的7.5倍和是对照培养基(不加细胞分裂素的体胚诱导培养基)所诱导的体胚形成频率的150倍。在M4培养基中，44﹪的成熟体胚萌发成正常的植株。活性炭(AC)对再生植株的生根的进一步发育具有明显的促进作用。
建立了龙牙蕉原生质体培养及植株再生体系。与贡蕉原生质体分离相比，用于龙牙蕉原生质体分离的酶液需要保持一定的渗透压以保护原生质体不被破坏。当甘露醇的浓度为0.41 M时，原生质体产量最高，达到3.1×10<7>个/mLPCVECS。酶溶解液的pH值也影响到龙牙蕉原生质体的分离。看护培养15 d的原生质体分裂频率达可到50﹪以上，培养45 d时PDCC形成率达到45﹪。在培养基中加0.8μM zT对PDCC的体胚形成有强烈的促进作用，但是所获得的体胚都是畸形胚，不能进一步萌发成为植株；加TDZ(0.8μM，1.2μM，1.6μM)可使从PDCC形成的体胚玻璃化现象严重；加4.4μM BAP，虽然所获得的体胚频率较低(1.5×10<3>个体胚/mL，PCV PDCC)，但是有7.8﹪的体胚能萌发形成正常植株。
在研究AGPs与悬浮细胞胚性维持关系的基础上，探讨了看护培养的可能机理。首先采用火箭琼脂糖凝胶电泳法测定了培养15 d后的香蕉胚性悬浮细胞和非胚性悬浮细胞的M2悬浮培养基中AGPs含量，发现具有体胚发生能力的贡蕉、大蕉(Musa paradisiaca Linn．cV．Da Jiao ABB)和龙牙蕉胚性悬浮细胞培养基中的AGPs含量分别达到36、48、56 mg/mL，而在不能进行体胚诱导的威廉斯(Musa AAA cv．Williams)非胚性悬浮细胞的培养基中检测不到AGPs。说明悬浮细胞分泌到培养基中的AGPs含量与香蕉细胞的体胚发生能力有一定的关系。此外，在龙牙蕉ECS的悬浮培养过程中，添加不同浓度的BGlcY试剂(一种能与AGPs特异性结合并引起AGPs沉淀的人工合成化学物质)到悬浮培养基中可引起胚性细胞/非胚性细胞(ECS/NECS)的比值下降，而且随着BGlcY试剂浓度的升高，ECS/NECS从起初的11.9(不加BGlcY试剂时)降到0.19(BGlcY-试剂浓度为40μM时)。在龙牙蕉的ECS体胚诱导过程中，添加不同浓度BGlcY试剂到体胚诱导培养基中，引起体胚发生频率大大下降。体胚发生频率从最初的15.5×10<3>个体胚/mL PCV ECS(不加BGlcY-试剂时)下降到0.2×10<3>个体胚/mLPCV ECS(BGlcY-试剂浓度为60μM时)。这些结果表明，AGPs在香蕉悬浮细胞的胚性保持过程中起到重要的作用，并且具有剂量效应。同时也显示看护培养对原生质体培养的有利效果可能涉及AGPs的作用，因为看护培养中的‘看护细胞’常常是胚性细胞。为此，我们将龙牙蕉的原生质体培养于不同的培养体系中进一步探讨看护培养的可能机理：(1)原生质体悬浮于培养基．B中，进行看护培养；(2)在(1)培养条件中，加60μM BGlcY-试剂于看护培养基中；(3)原生质体悬浮于培养基．B中进行液体培养；(4)原生质体悬浮于培养基-B+30μg/mLAGPs培养基中进行液体培养。结果发现：在体系(1)中，所获得的细胞团为胚性，这些细胞团可进一步通过体胚发生途径再生植株；在体系(2)中，原生质体的表现与在(3)原生质体培养在液体培养基中的表现一样，所形成的细胞团也呈非胚性状态，不能进一步发育为体胚；在体系(4)中，所形成的绝大多数细胞团表现与体系(3)中所形成的细胞团表现相似，细胞失去胚性潜力，但有6.4﹪左右细胞在培养过程中还能保持胚性特征，但这些细胞团还不能进一步发育成为体胚。这说明在(4)中加30μg/mL AGPs可使部分细胞保留胚性。同时也间接说明看护培养法可成功地使原生质体通过体胚发生途径再生植株与看护细胞分泌AGPs有关。
采用原生质体不对称融合技术进行了龙牙蕉和贡蕉体细胞杂交的研究。以碘乙酰胺(IOA)处理的龙牙蕉原生质体作为受体，以50μW/mm<2>强度的紫外线(UV)照射处理的贡蕉原生质体作为供体，进行原生质体不对称融合。结果表明：1.5 mM浓度的IOA足以抑制受体龙牙蕉原生质体的植株再生；60 s、120 s、180s的UV照射后贡蕉原生质体都不能再生获得植株。PEG浓度为20﹪时，原生质体双融合率最高，达到13.6﹪。对贡蕉原生质体进行不同剂量(60 s、120 s、180s)的UV照射处理，再与1.5 mM浓度的IOA处理后的龙牙蕉原生质体进行融合。当Uv照射120 s时所获得的植株再生频率最高(29株/1×10<5>个原生质体)。这些再生植株经过RAPD分析，有50﹪的植株为体细胞杂种。分析每一个引物所扩增的杂种RAPD-DNA组成，发现这些杂种含有全部的龙牙蕉亲本DNA带(6-7条，占总的龙牙蕉RAPD-DNA带的100﹪)，部分贡蕉亲本DNA带(1-2条，占总的贡蕉RAPD-DNA带的20﹪左右)，杂种再生植株基因组表现为高度不对称。这表明龙牙蕉原生质体和经过UV照射的贡蕉原生质体融合后产生的后代为不对称杂种。