【摘 要】
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链格孢属致病真菌适应能力强,寄主广泛,能侵染超过200种植物,会随空气、土壤传播,还会以孢子的形式附着在种子表面,条件适宜会迅速萌发,引起大规模的植物病害,造成巨大经济损失。微生物源农药不易使病原菌产生耐药性并且易于降解,危害较小。放线菌可以产生1000种以上的抗生素,多数应用于农业生产中,是目前微生物源农药研发中应用最多的菌属。因此,筛选拮抗放线菌并对其次级代谢产物进行研究对于防治链格孢属病原菌
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链格孢属致病真菌适应能力强,寄主广泛,能侵染超过200种植物,会随空气、土壤传播,还会以孢子的形式附着在种子表面,条件适宜会迅速萌发,引起大规模的植物病害,造成巨大经济损失。微生物源农药不易使病原菌产生耐药性并且易于降解,危害较小。放线菌可以产生1000种以上的抗生素,多数应用于农业生产中,是目前微生物源农药研发中应用最多的菌属。因此,筛选拮抗放线菌并对其次级代谢产物进行研究对于防治链格孢属病原菌引发的植物病害和新型微生物源农用抗生素的开发有重要意义。东北农业大学校园内大量种植的景观绿肥植物二月兰发生了严重的叶斑病病害,为探究二月兰叶斑病病原菌类型及微生物防控措施,本研究首先采集患叶斑病的叶片进行致病菌的分离、验证和鉴定,再以白菜根际土壤和杂草盐碱地土壤作为分离源,使用6种分离培养基进行放线菌的分离,从中筛选并得到对叶斑病病原菌拮抗活性较好的菌株,进行初步鉴定和活性次级代谢产物的分离,并对其主要活性物质进行结构鉴定和活性测定,同时对该物质可能的抑菌机理进行初步探究。主要实验结果如下:（1）从患叶斑病二月兰叶片中分离病原菌,得到2株致病真菌,通过形态观察和分子水平分析,鉴定为交链格孢（Alternaria alternata）和细极链格孢（Alternaria tenuissima）。（2）对两份土壤样品进行放线菌分离,多次纯化,合并相同菌株后共得到159株菌,其中白菜根际土壤分离到127株,杂草盐碱地土壤32株,通过形态观察,发现其中80%以上为链霉菌属,少数为其他菌属。（3）以链格孢属代表菌株交链格孢（Alternaria alternata）为活性测试菌株,对分离到的159株菌进行活性测定,其中20株抑菌活性较好,分离于杂草盐碱地土壤的菌株NEAU-ZC16抑菌率最高,达到69.77%,该菌还具较好的广谱抑菌活性,对番茄黄萎病菌和水稻立枯病菌的抑制率均在60%以上。为明确其分类地位,进行了初步的鉴定,生理生化实验表明菌株可以在p H=12、Na Cl浓度4%的环境下生长,具有良好的耐盐碱特性,功能探究发现其具有产生纤维素酶、蛋白酶等降解酶类和吲哚乙酸的能力,这些能力与菌株抗病、促生能力息息相关,通过16S r RNA测序和系统发育树的构建,最终鉴定菌株NEAU-ZC16为链霉菌属。（4）对菌株NEAU-ZC16进行液体发酵,采用硅胶柱层析、凝胶柱层析和高效液相色谱制备等化合物分离纯化方法,并通过活性追踪法分离对链格孢病菌具有抑菌活性的次级代谢产物,最终获得活性组分Ⅲ-2-1、Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3和Ⅱ-4,其中Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3和Ⅱ-4对链格孢病原菌的抑制率较小,不是菌株NEAU-ZC16的主要抑菌成分,但对G+细菌有抑菌活性,Ⅲ-2-1对链格孢病菌的抑制率为53.19%,判断是菌株NEAU-ZC16的主要活性物质,为白色粉末。虽然获得了Ⅲ-2-1的~1H-NMR谱图和13C-NMR谱图,由于制备的活性物质质量较少并且结构复杂,目前还未完成其结构的解析。（5）通过菌丝生长速率法、离体叶片法等活性测定方法对主要活性物质Ⅲ-2-1的抑菌活性进行研究。菌丝生长速率实验结果显示,Ⅲ-2-1在平皿内对链格孢病原菌表现出良好的抑菌活性,EC50值为1.89μg/m L。选择油菜叶片进行离体叶片防效实验,结果表明在离体叶片上Ⅲ-2-1对链格孢病原菌表现出较好的抑菌活性和防治效果,先喷施浓度为20μg/m L和40μg/m L的Ⅲ-2-1后接种链格孢病原菌,防效分别为93.16%和97.44%。采用滤纸片法对Ⅲ-2-1的广谱抑菌活性进行研究,结果显示Ⅲ-2-1对包括黄瓜棒孢病菌和甜瓜枯萎病菌在内的10种植物病原真菌均表现出抑菌活性,抑制率在17.07%-56.97%范围内不等。（6）对活性物质Ⅲ-2-1的抑菌机制进行初步探究,Ⅲ-2-1处理后,链格孢病原菌的干重和孢子萌发率受到显著抑制,随着浓度的增大,抑制率也逐渐增大,20μg/m L的Ⅲ-2-1处理对菌丝干物质量积累的抑制率达到81.99%,对孢子萌发的抑制率为66.15%。Ⅲ-2-1还会引起菌丝的形态异常,显微镜下观察到实验组菌丝表面粗糙,不规则弯曲、浓缩、聚集和顶端膨大,但未见细胞壁和细胞膜有明显的破损和内容物的渗出。Ⅲ-2-1对渗透调节物质丙二醛、可溶性蛋白和核酸含量几乎没有影响,表明Ⅲ-2-1处理不会破坏链格孢病菌菌丝细胞壁和细胞膜的完整性。
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