α-半乳糖苷酶是能够催化α-半乳糖苷键水解的酶,被广泛应用于食品、饲料加工等领域。寻找新酶并详细研究其功能,可丰富α-半乳糖苷酶资源,推动其理论和应用研究。α-半乳糖苷酶几乎存在于所有生物体中,微生物是其主要来源。嗜糖黄杆菌（Flavobacterium saccharophilum）是能够降解半纤维素等糖类化合物的细菌,基因组注释结果表明,嗜糖黄杆菌中含有包括α-半乳糖苷酶在内的多种糖苷水解酶假定基因。目前,对嗜糖黄杆菌中糖苷酶的研究较少,仅有2种木聚糖酶和葡聚糖酶的报道。本研究主要克隆表达嗜糖黄杆菌中α-半乳糖苷酶基因,系统研究重组酶的功能,主要研究结果如下:1.以嗜糖黄杆菌的基因组为模板,成功克隆出两个α-半乳糖苷酶基因fsgal27和fsgal36。将目的基因与p ET-28a载体连接后转移到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,获得重组菌株。重组菌株经IPTG诱导,实现了重组蛋白FsGal27和FsGal36的可溶性表达。经亲和层析纯化后,可得到高纯度的目的蛋白,分子量分别约为52 k Da和83 k Da。2.以对硝基苯基-α-D-半乳糖苷为底物对FsGal27和FsGal36的酶学性质进行了研究。FsGal27比酶活为0.6 U/mg,最适p H为6.0,最适反应温度为40℃;FsGal36比酶活为10.0 U/mg,最适p H为6.0,最适反应温度为45℃。Na+、K+和Mg2+可增强FsGal27的酶活力。Cu2+、Hg2+和SDS对FsGal36有较强抑制作用。FsGal27的Km值为0.79±0.02m M,Vmax值为3.11±0.16μmol/min/mg。FsGal36的Km值为0.24±0.01 m M,Vmax值为4.76±0.26μmol/min/mg。3.以一系列pNP糖苷为底物分析FsGal27和FsGal36的糖基选择性,两者都只能水解pNP-α-Gal,为专一的α-半乳糖苷酶。进一步以不同连接方式的α-半乳二糖为底物研究FsGal27和FsGal36的键型选择性,结果表明FsGal27只能水解α-1,6-半乳二糖,是一种选择性专一的外切α-1,6半乳糖苷酶。FsGal36可以同时水解α-1,2/1,3/1,6键型的半乳二糖,是一种选择性广泛的外切α-半乳糖苷酶。以三种具有不同侧链结构的α-1,6-半乳聚糖为底物进一步研究FsGal27和FsGal36的功能。FsGal27和FsGal36几乎可以将鸡油菌多糖彻底水解,说明主链甲基取代不会影响水解能力。而对于分支度较高的连接有甘露糖侧链的白玉菇和杏鲍菇多糖则不能彻底水解。与甘露糖苷酶共同作用后,两种酶可将白玉菇和杏鲍菇多糖彻底水解,表明甘露糖取代和较高的分支度影响酶的活力。FsGal27还可以水解半乳甘露聚糖侧链中的半乳糖,而FsGal36对半乳甘露聚糖无水解活性,但FsGal36与甘露聚糖酶共同作用时可以促进半乳甘露聚糖的降解,表明两者有协同作用。同样,FsGal27与甘露聚糖酶也可以协同降解半乳甘露聚糖。综上,本论文成功获得了嗜糖黄杆菌中FsGal27和FsGal36两个新的α-半乳糖苷酶。FsGal27是一种选择性专一的外切α-1,6-半乳糖苷酶,能够水解α-1,6-半乳聚糖和半乳甘露聚糖。FsGal36是一种选择性广泛的外切α-半乳糖苷酶,可以水解α-1,6-半乳聚糖。此外,FsGal27和FsGal36都可以与甘露聚糖酶协同降解半乳甘露聚糖。通过对FsGal27和FsGal36性质与功能的深入研究,不仅填补了嗜糖黄杆菌中α-半乳糖苷酶研究的空白,还获得了新功能的酶,为酶在糖类化合物研究中的应用提供了理论基础。