研究背景与目的前列腺癌是男性最高发肿瘤,随着PSA筛查的普及,我国的前列腺癌新发人数逐年上升,且其造成的死亡人数仅次于肺癌,给老年男性的健康带来了巨大威胁,给家庭和社会造成了严重的负担。前列腺癌具有亲骨性,60%-80%因前列腺癌死亡的病人伴有骨转移的发生。由于顽固性骨痛骨、骨折、脊髓神经压迫、高钙血症和造血功能障碍等骨相关事件(skeletal-related events,SREs)的发生,前列腺癌骨转移患者的生活质量较差且生存率较低。目前,针对前列腺癌骨转移相关症状治疗的主要目的之一在于控制骨相关症状,提高患者生活质量。为了达到此目的,临床常用双磷酸盐、RANKL中和抗体等药物抑制破骨细胞功能,但这些治疗方式并不能有效提高患者的生存率。此外,放化疗会带来较大的副作用,降低患者的生存质量。因此,寻找一种既能控制骨转移症状,又能控制肿瘤进展,同时具有较小毒副作用的药物显得尤为重要。但是,研发新药需要较长的周期、人力和物力,且存在较大的临床转化障碍。与此相反的是,老药新用的策略(药物重定位)则可在较短的周期内,挖掘现有药物的未知功效,并运用到其余疾病的治疗中,是研发抗癌药物的一种快速高效的策略。盐霉素是一种离子载体类抗生素,在畜牧行业中常用其防治病虫害。近年来,有研究发现其具有抗肿瘤活性,可特异性杀灭乳腺癌干细胞,并在前列腺癌、卵巢癌和肝癌等诸多肿瘤中发现了相似的抗癌作用。更多深入的研究发现了盐霉素对肿瘤细胞氧化应激、线粒体生物合成和自噬的发生等生物过程具有重要调节作用。但是面对盐霉素引起的诸多现象及其相应的机制,并无统一的、全面的机制能够解释其多样化的药物作用。药物分子(作为配体)同大分子靶点的相互作用是药物发挥作用的根本之一,小分子药物发挥作用的模式包括最常见的静电作用,如离子键、氢键和范德华力等;较为紧密的共价键结合以及疏水结合等。盐霉素发挥药效的具体机制尚属未知。此外,对盐霉素敏感的肿瘤类型中,乳腺癌和前列腺癌具有性激素依赖性和亲骨性等共同点,目前已知盐霉素能够抑制前列腺癌雄激素受体的表达,但其对前列腺癌骨转移是否有治疗作用尚无报道。因此,本课题的目的在于研究盐霉素对前列腺癌骨转移的作用及其发挥作用的生理和分子机制,通过药物重定位的策略,探寻将盐霉素作为前列腺癌骨相关事件乃至晚期前列腺癌的临床治疗新途径。同时,本课题欲初步探索盐霉素可能的结合靶点,为将盐霉素作为一种新型抗肿瘤药物打下基础。实验方法1、细胞实验:利用CCK-8细胞增值实验测定盐霉素对前列腺癌细胞系、成骨细胞前体细胞、破骨细胞前体细胞的抑制作用,并计算半数效应计量;利用细胞划痕愈合实验、transwell小室迁移/侵袭实验(覆盖或不覆盖matrigel胶)检测盐霉素对肿瘤细胞的迁移和侵袭能力的影响;利用流式细胞仪和克隆形成实验检测盐霉素对肿瘤细胞凋亡率和细胞周期的影响;利用成骨细胞分化培养基与前列腺癌细胞条件培养基诱导骨髓间充质干细胞、脐带间质干细胞向成骨细胞分化,并检测盐霉素对该过程的影响;利用m-CSF与Rank Ligand诱导小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化,并检测其对骨板的吸收能力,同时检测盐霉素对破骨分化和骨吸收的影响;使用质粒、干扰RNA转染和慢病毒感染等方式调控细胞内基因的表达;2、分子实验:通过蛋白印迹实验(Western Blot,WB)、蛋白免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,co-IP)、实时定量多聚酶链式反应(Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)、免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)、免疫荧光(Immunofluorescence,IF)研究基因、蛋白质的表达量变化情况、相互作用及蛋白质细胞定位;苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H&E)研究组织形态和结构以及其变化;分别使用碱性磷酸酶(ALP)染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测成骨细胞与破骨细胞分化;使用茜素红染色检测成骨细胞钙沉积;通过氨基-羧基脱水缩合反应(DMAP催化条件下)制备磁珠-盐霉素复合物;通过普鲁士蓝染色检测组织中铁离子含量;通过Liperfluo试剂检测细胞内脂质过氧化物含量;3、体内实验:采用慢病毒感染的方法构建稳定表达荧光素酶(luciferase)的前列腺癌骨转移细胞系,并采用在Nod-Scid小鼠左心室注射或胫骨原位注射的方式构建前列腺癌骨转移模型;采用小鼠腹腔注射的方式给药;使用小鼠活体成像仪拍摄并记录肿瘤荧光强度;使用4%多聚甲醛固定小鼠骨组织48小时后换用酒精固定,此后用EDTA脱钙两周;4、影像学检测:MicroCT检测小鼠胫骨CT值,检测胫骨近端骨骺端骨小梁密度、数量、厚度、分离度等指标,并以计算机辅助进行数据三维重建,构建三维图像和动态图像;电镜观察盐霉素对前列腺癌线粒体、溶酶体等细胞亚结构的影响;5、化学信息学分析:为了探寻盐霉素的潜在靶点,我们使用了SwissTargetPrediction网站(http://www.swisstargetprediction.ch)的小分子靶点预测功能以及基于PDB数据库的计算机模拟晶体匹配度筛选策略;采用计算机模拟分析对接的方法模拟盐霉素-蛋白质的结合模式;采用LeDock_GO软件进行计算机模拟药物-蛋白结合(分子对接)实验;6、高通量测序及公共数据提取:使用了mRNA转录组测序研究盐霉素对前列腺癌细胞转录组的调控作用;使用了GCBI网站对公共数据库的芯片数据进行分析,用于探索成骨细胞和前列腺癌细胞的相互作用;7、分子-蛋白质亲和力检测:采用了表面等离子共振(SPR)技术检测盐霉素与靶蛋白的亲和力。实验结果第一部分:盐霉素抑制前列腺癌细胞骨转移1、CCK-8实验显示盐霉素可显著抑制前列腺癌细胞增殖,但对正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)和前列腺增生上皮细胞(BPH-1)的作用较弱;2、盐霉素致使前列腺癌细胞凋亡率升高;3、划痕和迁移、侵袭小室实验表明,盐霉素可显著增大前列腺癌骨转移细胞系(C4-2B、PC-3)的划痕面积、减少迁移至0.8μm尼龙膜下的细胞数量。4、小鼠左心室注射前列腺癌骨转移C4-2B和PC-3细胞系,均成功构建全身肿瘤转移模型,盐霉素治疗组的肿瘤转移灶数量及骨转移灶数量均少于对照组;5、通过小鼠胫骨平台向骨髓腔注射前列腺癌细胞构建前列腺癌胫骨荷瘤模型具有较高的成功率和稳定性,盐霉素治疗组的肿瘤荧光强度明显弱于对照组;6、骨MicroCT检测显示,C4-2B细胞系构建的骨荷瘤模型主要呈成骨性生长,而PC-3细胞系构建的骨荷瘤模型则表现为溶骨性;在C4-2B骨荷瘤模型中,盐霉素治疗组小鼠的胫骨骨小梁密度明显高于对照组,但异位成骨却受到明显抑制,骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)略有上升,骨小梁分离度(Tb.Sp)略有下降;在PC-3骨荷瘤模型中,盐霉素治疗组小鼠的胫骨骨小梁密度明显高于对照组,肿瘤介导的骨吸收明显减弱,骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)显著上升,骨小梁分离度(Tb.Sp)显著下降;7、H&E染色切片显示盐霉素治疗组小鼠胫骨异位成骨和受肿瘤破坏程度均下降;IHC染色发现盐霉素治疗组肿瘤细胞Caspase-3凋亡相关蛋白染色加深。第二部分:盐霉素抑制肿瘤-成骨-破骨恶性循环的发生1、盐霉素处理C4-2B细胞系后mRNA测序显示有6183个基因转录水平发生1.5倍以上变化,其中1685个基因的变化水平超过4倍;凋亡相关蛋白Caspase-3的编码基因CASP3上升1.73倍;增殖相关基因MKI67表达下调5.89倍;GO分析提示:受到盐霉素处理的前列腺癌细胞,DNA复制受到明显抑制;KEGG富集分析发现盐霉素致使肿瘤铁死亡途径被显著激活;细胞因子-受体相互作用相关的通路也发生了明显的改变;DNA复制和细胞周期相关通路被明显抑制;2、盐霉素将前列腺癌细胞周期阻滞在G0/G1期;克隆形成实验中,盐霉素处理组的前列腺癌细胞克隆数量明显减少;盐霉素致使前列腺癌细胞表面铁转运蛋白受体CD71表达增多;盐霉素导致CD71蛋白的mRNA下降;铁死亡促进剂可将盐霉素对PC-3细胞的抑制作用提高20余倍;盐霉素联用铁死亡促进剂后,前列腺癌在小鼠胫骨中的生长明显弱于单独使用盐霉素治疗组;3、盐霉素对成骨细胞不具有抑制增殖的功能;盐霉素不能抑制成骨分化培养基对成骨细胞前体细胞的诱导分化过程;盐霉素抑制前列腺癌诱导的成骨细胞分化;盐霉素抑制前列腺癌细胞合成及释放TGFb-1;盐霉素治疗组的小鼠荷瘤胫骨ALP染色强度明显降低;4、盐霉素抑制破骨细胞增殖及破骨分化和骨吸收功能;盐霉素抑制单核巨噬细胞向破骨细胞分化过程中Cathepsin K(Ctsk)、ATPase H~+transporting V0 subunit d2(Atp6v0d2)和Acid Phosphatase 5,Tartrate Resistant(Acp5)等基因的表达,并具有浓度依赖性;盐霉素治疗组的小鼠荷瘤胫骨TRAP染色强度明显降低。第三部分:盐霉素发挥药效的分子机制及验证1、采用化学信息学方法在SwissTargetPrediction数据库中筛选到15个盐霉素潜在靶蛋白;用SEA法在PBD数据库中筛选到5个盐霉素靶蛋白;计算机模拟对接实验发现盐霉素可与预测的5个靶蛋白结合,其中3个蛋白亲和力较低,2个蛋白亲和力较高;与盐霉素亲和力最高的靶点是14-3-3ζ/C-RAF蛋白复合体,盐霉素的羧基与14-3-3ζ/C-RAF界面处的钾离子相互作用,并与Lys120和与Ser45的氢键形成盐桥。相邻的乙基深入嵌合到14-3-3ζ蛋白Lys120和Phe117之间的疏水裂缝中,形成较为稳定的结构;2、挑选了分子对接预测亲和力最高的配体14-3-3ζ/C-RAF蛋白复合体进行结合实验验证,盐霉素磁珠IP产物中,蛋白质谱分析发现存在14-3-3ζ蛋白;SPR实验验证盐霉素与14-3-3ζ蛋白结合;3、IP结果显示,盐霉素处理前列腺癌细胞后,14-3-3ζ与C-RAF、YAP-1、β-Catenin蛋白的结合增多;免疫荧光显示,盐霉素处理后的前列腺癌细胞中,YAP-1和β-Catenin入核受到抑制,滞留在细胞质中;4、敲除14-3-3ζ后,盐霉素在低浓度下对前列腺癌细胞的抑制作用明显减弱;敲除14-3-3ζ后,盐霉素对小鼠体内肿瘤生长的抑制作用下降。结论本课题采用药物重定位的策略,发现了盐霉素抗前列腺癌骨转移的功能。盐霉素通过作用于前列腺癌细胞、破骨细胞以及前列腺癌与成骨细胞的相互作用,达到抑制前列腺癌骨转移的功能。对于肿瘤细胞而言,盐霉素可阻滞其周期、诱导其铁死亡,从而抑制其转移能力;对于破骨细胞而言,盐霉素抑制其分化,阻碍其骨吸收;对于成骨细胞而言,盐霉素不能抑制其增值或分化,但盐霉素可阻断肿瘤分泌TGF-β1,从而阻断肿瘤介导的成骨细胞分化和异位成骨。化学信息学分析发现了盐霉素潜在的结合靶点,我们挑选并实验验证了14-3-3ζ蛋白可作为盐霉素发挥药效的靶点之一。综上所述,盐霉素可增加14-3-3ζ蛋白与靶蛋白之间的结合能力,起到类似“双面胶”或“脚手架”的作用,使复合物稳定性提高,抑制C-RAF、YAP-1以及β-Catenin等肿瘤相关蛋白的功能,同时抑制锌指蛋白36和转铁蛋白受体的mRNA结合,从而引起肿瘤表形改变,表现为周期受阻、转移能力下降、分泌细胞因子(如TGF-β1)受阻和细胞摄取铁增加等。此外,Hippo、Wnt通路在破骨细胞分化过程中扮演了重要角色,盐霉素通过抑制YAP-1及β-Catenin入核发挥功能,抑制破骨细胞分化。其次,盐霉素通过抑制前列腺癌细胞TGF-β1的分泌,阻断了前列腺癌细胞诱导的成骨细胞分化和成骨过程。因此,盐霉素同时对前列腺癌骨转移中涉及的肿瘤细胞、成骨细胞、破骨细胞这三个关键因素发挥了抑制作用,从而抑制了前列腺癌骨转移。盐霉素或可成为一种经济高效的抗前列腺癌骨转移药物。