肌腱蛋白C在百草枯中毒肺损伤中的作用

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目的:肌腱蛋白C(Tenascin-C,TNC)是一种细胞外大分子基质糖蛋白,参与组织损伤修复过程,在炎症,纤维化及肿瘤疾病发生发展中发挥重要作用。最近的研究表明,TNC在肺间质性疾病中高表达,而在百草枯(Paraquat,PQ)肺损伤中的作用如何尚无报道。本研究旨在探讨TNC在百草枯中毒小鼠肺损伤中的作用及可能机制。方法:C57BL/6雄性小鼠经腹腔注射30mg/kg PQ建立动物模型,对照组为同等剂量生理盐水腹腔注射,每组各10只。接触PQ后2d,7d,14d和28d处死小鼠取肺组织标本。苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin,HE)观察各组小鼠肺病理学改变。胶原染色反映各组肺组织中胶原生成及分布情况。RT-qPCR,Western blot和免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)的方法检测TNC基因和蛋白在小鼠肺组织中随时间的表达规律及定位,Western blot检测NF-κB p65,α-SMA和TGF-β1在肺组织中随时间的表达规律。A549细胞培养在含100uMPQ的培养基中建立PQ体外模型,对照组培养在不含PQ的培养基中。分别于6h,24h,2d和7d收集细胞用于检测。RT-qPCR和Western blot分别检测A549细胞TNC及TGF-β1的基因及蛋白表达情况。体外TNC siRNA转染实验分为4组,分别是对照组,TNC siRNA转染对照组,PQ组,PQ+TNC siRNA组。各组在加入PQ作用后2d收集细胞进行检测TNC的基因表达以及TGF-β1的基因和蛋白表达情况。结果:肺HE染色结果显示肺损伤表现,胶原染色发现在7d和14d明显的胶原沉积。TNC蛋白表达在接触PQ后2d升高,7d达高峰,之后表达降低,并在28d与对照组比较无组间差异。TNC基因水平表达高峰提前到2d,之后降低,在14d,28d表达无差异。IHC染色发现,TNC在主要分布于损伤的肺泡间质区。NF-κB p65在接触PQ后2d出现表达峰值,α-SMA在接触后14d和28d高表达,TGF-β1高表达贯穿整个实验始终(P<0.05)。体外模型中,TNC在A549细胞与PQ共培养后,出现基因和蛋白水平的升高,且高峰期在24h。同时TGF-β1在2d和7d呈现高表达。TNC siRNA转染结果显示,TNC有效敲除组在PQ作用2d后的TGF-β1基因和蛋白表达相较于未敲除组明显降低。结论:首次发现TNC在PQ中毒诱发肺损伤过程中的高表达及表达规律,提示TNC参与了此过程并发挥重要作用,并且相关机制与TGF-β1相关。
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