【摘 要】
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目的:分离及克隆胰腺癌BxPC-3和PC-3细胞基因组中反义K-ras基因片段（外显子1及其侧翼序列,外显子4B及其侧翼序列）,构建含反义K-ras癌基因的重组逆转录病毒载体,并制备含反义K-r
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目的:分离及克隆胰腺癌BxPC-3和PC-3细胞基因组中反义K-ras基因片段（外显子1及其侧翼序列,外显子4B及其侧翼序列）,构建含反义K-ras癌基因的重组逆转录病毒载体,并制备含反义K-ras癌基因重组逆转录病毒,在体外和体内水平探讨其治疗胰腺癌的作用及其分子机制。方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引入BamHI和EcoRI位点,分别以胰腺癌细胞株BxPC-3和PC-3细胞基因组DNA为模板扩增出反义K-ras基因外显子1,4及侧翼序列,BamHI和EcoRI双酶切PCR产物及空载体pLXSN,用T4连接酶作用后构建重组逆转录病毒载体,经G418筛选后获得抗性克隆。予菌液PCR和限制性内切酶酶切及序列分析鉴定正确后命名为pLXSN-AS-exonl和pLXSN-AS-exon4B,利用脂质体将其转导入PT-67细胞（逆转录病毒包装细胞）,再经G418筛选得到抗性克隆。将抗性PT-67细胞进行扩大培养,得到含重组逆转录病毒的上清。将重组逆转录病毒上清感染胰腺癌BxPC-3和PC-3细胞,筛选得到抗性细胞,利用MTT法检测其细胞增殖情况;RT-PCR法检测K-ras mRNA;免疫组化（SABC法）进行p21表达和凋亡相关基因Fas、FasL、Bax、Bcl-2的表达研究。感染重组病毒前后的胰腺癌BxPC-3和PC-3细胞予碘化丙锭（PI）染色,70%酒精固定后送流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况。应用重组逆转录病毒pLXSN-AS-exonl和pLXSN-AS—exon4B 200μL连续3天注入裸鼠胰腺癌接种局部,每周观察移植瘤的大小和体积,待8周后处死称重。结果:经菌液PCR、BamHI和EcoRI双酶切及序列分析后证实K-ras基因外显子1,4及侧翼序列已成功地克隆入pLXSN中。重组逆转录
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