【摘 要】
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背景黑色素瘤是皮肤癌中最具侵袭性和转移性的恶性肿瘤,其死亡率高,预后差,这与肿瘤细胞有效的转移性定植有关,但它的机制仍难以捉摸。肿瘤转移是一个复杂的病理过程,其中细胞间的信息交流是肿瘤转移和进展的关键,肿瘤细胞不仅可以在原发肿瘤微环境中释放局部信号,还可以向远端将要转移的部位发出信号,以促进形成一个良好的转移前生态位,这将促进转移性肿瘤细胞的生长。外泌体作为细胞间信息交流的主要媒介物质,参与了肿瘤
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背景黑色素瘤是皮肤癌中最具侵袭性和转移性的恶性肿瘤,其死亡率高,预后差,这与肿瘤细胞有效的转移性定植有关,但它的机制仍难以捉摸。肿瘤转移是一个复杂的病理过程,其中细胞间的信息交流是肿瘤转移和进展的关键,肿瘤细胞不仅可以在原发肿瘤微环境中释放局部信号,还可以向远端将要转移的部位发出信号,以促进形成一个良好的转移前生态位,这将促进转移性肿瘤细胞的生长。外泌体作为细胞间信息交流的主要媒介物质,参与了肿瘤转移的过程。剖析外泌体促进肿瘤细胞与转移微环境相互作用的机制,重点关注肿瘤细胞来源的外泌体在调节基质细胞功能中的作用,对于肿瘤细胞间通过外泌体相互串扰影响肿瘤转移的机制研究还相对缺乏。肿瘤干细胞（CSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞亚群,是导致黑色素瘤转移和耐药的主要原因。一些研究表明,黑色素瘤细胞可通过外泌体来源的micro RNA、lnc RNA和蛋白质等改变转移微环境中的其他非肿瘤细胞的转移特性,对于黑色素瘤干细胞介导的外泌体是否也可以改变非肿瘤干细胞的转移特性在本研究前还未报道过。值得注意的是,在转移过程中作为通讯分子的miR-1268a是一个目前研究相对较少的miRNA,主要与血管的生成,胚胎和细胞的分化以及药物敏感性有关,对于其通过外泌体作用于受体细胞影响肿瘤转移特性的机制研究鲜有报道。目的1、探讨黑色素瘤干细胞（OL-SCs）分泌的外泌体对低转移性黑色素瘤细胞（OL）转移的影响;2、筛选OL-SCs细胞与OL细胞的外泌体内差异表达的miRNA;3、验证来源于OL-SCs外泌体的miR-1268a对肿瘤转移的影响;4、研究miR-1268a促进黑色素瘤肿瘤转移的机制。方法1、通过对细胞培养液进行超速离心提取细胞外泌体;2、使用透射电镜（Transmission Electron Microscope,TEM）、纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）、蛋白质印记法（Western blot,WB）鉴定外泌体;3、采用miRNA测序技术对三组来源于OL-SCs细胞和OL细胞的外泌体进行测序,获取差异表达的miRNA;4、通过转染mimics和感染慢病毒过表达目的基因,转染siRNA和inhibitor沉默目的基因;5、采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）检测细胞和外泌体内目的基因的表达水平;6、通过CY5标记miR-1268a,亲脂性染料PKH26标记外泌体,共聚焦显微镜观察miRNA和外泌体的共定位情况;7、通过Transwell迁移侵袭实验检测低转移性黑色素瘤细胞的体外转移能力;通过小鼠尾静脉肿瘤移植实验检测低转移性黑色素瘤细胞的体内转移性定植能力;8、通过生物信息学的方法分析miR-1268a的靶基因以及其靶基因的信号通路富集;9、通过WB、TEM以及免疫荧光实验观察细胞自噬水平的变化。结果1、WB、NTA和TEM结果显示了我们所提取得到的囊泡具有双层膜结构,直径范围在40-160nm范围内且表达CD63、CD81、TSG101外泌体标志蛋白。2、OL-SCs细胞分泌的外泌体可以体外促进OL细胞的迁移侵袭能力。3、miRNA测序和RT-qPCR结果显示相较于OL细胞来源的外泌体,来源于OL-SCs细胞的外泌体中有7个上调的差异表达miRNA,其中miR-1268a无论在OL-SCs细胞内,还是在其外泌体内,表达水平均是最高的。4、OL-SCs细胞中高表达的miR-1268a可以通过外泌体转运至OL细胞中,体内、外促进黑色素瘤细胞的转移定植。5、miR-1268a可以通过调控自噬通路中多个靶基因的表达,从而抑制自噬通路,促进OL细胞的迁移侵和袭能力。结论本研究显示了肿瘤干细胞可以通过其分泌的外泌体改变非肿瘤干细胞的转移特性,我们首次证明了低转移性的黑色素瘤细胞可以从高转移性的肿瘤干细胞中获得“转移能力”,其机制是黑色素瘤干细胞介导的外泌体miR-1268a通过调控自噬通路中的多个靶基因,使自噬通路受到抑制,从而增强黑色素瘤的转移定植能力。
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