研究背景副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)主要存在于海洋环境中,可从各类海产品如鳕鱼、蛤、扇贝、龙虾、螃蟹和牡蛎等中检出,是引起食物中毒的重要病原体之一。生吃或误食含有Vp的海产品,尤其是贝类海产品容易导致急性肠胃炎,出现腹泻、头痛、呕吐、恶心、腹部绞痛和低热等症状。Vp是一种具有单一极性鞭毛,能在液体培养基中自由游动的革兰染色阴性弧菌,为多形态杆菌或稍弯曲弧菌,在含NaCl2%-4%的培养基中生长良好,最适生长温度为34-37℃,pH值范围是7.4-8.0。副溶血性弧菌的毒力因子主要有耐热直接溶血素(thermostable direct hemolysin, TDH)和耐热相关溶血毒素(TDH-related hemolysin, TRH)。前者能在我萋氏血平板上引起p-溶血(神奈川现象),具有致死毒性、心脏毒性、细胞毒性和肠毒素作用；后者虽不能引起神奈川现象,但与TDH有相似的免疫原性和67%的相同氨基酸序列,并同样具有致死作用和细胞毒性。编码这两种溶血素的基因分别是tdh和trh,均位于细菌染色体上,片段大小长约500-600bp。尽管Vp是引起食物中毒的重要病原菌,但大多数的Vp,尤其是环境分离株不携带毒力基因,不具有致病能力,只有少数携带毒力基因的菌株才致病。有鉴于此,本研究拟调查环境分离株毒力基因的携带情况。自1951年在大阪首次发现Vp以来,其引起的食物中毒占日本国内食物中毒事件总数的20%-30%,居食物中毒病因首位。在台湾1981-2003年的监测中,Vp占全部细菌性食物中毒事件的69%,也居首位。1991-2001年,Vp占中国食物中毒事件的31.1%。尽管由Vp引起的肠胃炎一般具有较好的自限性,但对肝病或免疫系统疾病人群,感染导致的败血症将危及生命。为有效预防Vp感染,准确检测海产品中的Vp十分必要。目前,检测Vp的方法主要有：1.培养法。传统培养法是国家规定的标准检测方法,该方法首先对样品增菌培养,再划线TCBS选择性平板,若在平板上观察到典型绿色菌落,挑取菌落进行一系列生化反应,根据反应结果来判断是否为副溶血性弧菌。由于此法能分离到活菌,并做生化鉴定确认,不仅对食物中毒病例具有确诊作用,还能为科学研究提供菌株来源。但该方法操作繁琐,挑取菌落步骤可能因经验不足或其它原因而漏掉目的菌落,所以敏感性不高,且增菌、分离培养步骤都分别需要18h以上,生化反应项目繁多,反应结果隔日才能知晓,整个检测过程费时费力,不适合大批量样本的检测。2.血清法。该法主要用于生化鉴定后的Vp分型,其通过O抗原和K抗原的不同组合将Vp分为65个亚型,并在世界范围内广泛应用于临床毒力株同源性研究和优势株研究。3.ELISA方法。在菌株(抗原)的检测上,无论是双抗体夹心法还是间接ELISA法,获得高质量的抗体是建立方法的关键。现阶段Vp抗体的制备,主要是通过灭活菌株或特异性蛋白(TLH)免疫动物获得多克隆抗体,而实际工作中此抗体效果并不佳。高质量的单克隆抗体的制备将会大大增加检测体系的成本,至今市面鲜见Vp的ELISA试剂盒。在Vp的检测上,分子生物学方法一直是研究的重点,其发展首先体现于不断更新的检测技术。Kaper等在1984年应用DNA杂交技术检测Vp毒力株的tdh基因,首次将DNA杂交技术应用到Vp的研究中；1992年Nishibuchi等首次应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术检测Vp的毒力基因,该技术一直沿用至今,广泛应用在Vp的检测中,堪称分子生物学中经典方法；Blackstone等在2003年将实时荧光PCR (Real-time PCR)技术用于含有tdh的毒力株检测,首次实现Vp检测从定性到定量的突破；2008年,Yamazaki等首次将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)应用到Vp的检测中,这种新型的检测方法所需仪器更简单,操作简便,为Vp分子检测法推广基层提供了坚实的技术保障。另外,分子生物学方法的发展还体现在检测靶序列的不断更新上。尽管16S rRNA序列在细菌中十分保守,常用于不同菌株的鉴定,但是在Vp的鉴定上,它却失去作用。这是因为弧菌间的16S rRNA序列同源性很高,比如副溶血性弧菌和溶藻弧菌的16S rRNA序列间有大于99%的相似性,所以我们急需找到一种更可靠的Vp种属特异性基因。通过大量经验的积累和序列的比对,最早发现的是编码不耐热性溶血毒素(thermolabile hemolysin, TLH)的tlh基因,随后又陆续发现pR72H、gyrB、toxR等基因。在实际检测中,我们会选择其中一种作为目的基因,来发现副溶血性弧菌。本次研究将从检测效果、操作性和经济性等多方面,对PCR法、Real-timePCR法和LAMP法三种分子检测方法作综合评价。国内许多企业已推出各种Vp检测分子试剂盒,试剂盒上市需通过一定评价,具有较好的真实性和重复性,能更好地代表性各自方法的特点,所以在本次研究中,三种分子检测方法均各自选择一种相应试剂盒代表其进行评价。目的1.综合评价三种Vp分子检测方法,并在现场标本检测中,以国标法为标准,评价三者效度。2.研究广州地区夏季部分Vp环境分离株携带毒力基因(tdh、trh)和整合酶基因特征。方法1.增菌与模板DNA提取用接种环挑取保存的实验菌株,接种于3%氯化钠碱性蛋白胨水中,37℃培养8h-18h,即为增菌液。水煮法提取细菌DNA。2.试剂盒选择选择国内PCR检测试剂盒(CAT#91201A-50)；实时荧光PCR检测试剂盒(Version Vp1); LAMP检测试剂盒(Version3, Sap.2009)代表各自分子检测方法,检测模板DNA,操作按照试剂盒说明书进行。3.最低检出限分析取标准参考株(Vp33847)作增菌培养,培养液进行10倍梯度的倍比稀释,得到10-7-100共8个稀释度的菌液,分别取1mL菌液提取DNA用于三种方法检测；同时每个稀释度取O.1mL菌液接种普通琼脂平板作菌落计数。4.特异性分析以副溶血性弧菌Vp33847、Vp14-90、Vp8-90、Vp25-9；创伤弧菌ATCC27562、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、伤寒沙门氏菌ST3216、小肠结肠炎耶尔森菌WA、香港海鸥菌LH679作为检测对象,评价三种检测方法特异性。5.试剂盒现场标本评价2010年7月至9月期间,在广州黄沙海产市场采样,采集到的海产品标本按副溶血性弧菌国家标准检测方法(GB/T 4789.7-2008)进行增菌和菌种保存。标本增菌液分别作国标法以及三种分子方法检测,计算各种方法检出率,多个检出率比较采用Cochran’s Q检验。以国标法检测结果为标准,分别评价三种方法的效度；并对其进行耗时、成本和操作性等评价。6.Vp分离株携带基因研究检测Vp环境分离株(国标法报告阳性)中毒力基因(tdh、trh)和Ⅰ类、Ⅱ类整合酶基因。PCR反应扩增出的目的条带纯化后,送往测序验证。结果1.最低检出限分析PCR试剂盒最低能检出1.18 103cfu/mL的稀释菌液,Real-time PCR试剂盒和LAMP试剂盒最低能检出11.8cfu/mL的稀释菌液。2.特异性分析实验室菌株经PCR、Real-time PCR和LAMP法检测,4株副溶血性弧菌结果均呈阳性,而其它菌株结果均呈阴性。3.试剂盒现场标本评价本次研究共收集205份海产品标本,其中东方对虾(Penacus orientalis) 25份、扇贝(Scallop)70份、蛤(clam)58份、缢蛏(Sinonovacula constricta)52份。国标法共检出65份阳性,检出率为31.7%；PCR试剂盒检出131份阳性,检出率63.9%；Real-time PCR试剂盒检出137份阳性,检出率66.8%；LAMP试剂盒检出135份阳性,检出率65.9%。以三种分子方法及国标法的检测结果做多个样本的Cochran’s Q检验,X2=189.078,P<0.001,四种检出方法检出率差异有统计学意义。再以三种分子方法的检测结果,做3个相关样本的Cochran’s Q检验,X2=5.091,P=0.78>0.05,三种分子间检出率差异无统计学意义。以国标法为标准评价三种分子方法效度,求得PCR、Real-time PCR和LAMP三种检测方法灵敏度分别为：100%、100%和100%；特异度分别为：52.9%、48.6%和50.0%；假阴性率均为0；假阳性率分别为：47.1%、51.4%和50.0%；正确指数分别为：0.53、0.49和0.50；符合率分别为：67.8%、64.9%和65.9%;Kappa值分别为：0.416、0.375和0.388；阳性预测值分别为：49.6%、47.4%和48.1%；阴性预测值均为：100%。三种试剂盒检测耗时分别为：120分钟、80分钟和80分钟：成本分别为：10元/次、40元/次和45元/次；操作性从难到易排列依次为：PCR、Real-time PCR和LAMP检测试剂盒。4.Vp分离株携带基因研究本次研究65株VP环境株中,所有环境分离株均未检测出trh基因及Ⅰ类和Ⅱ类整合子基因；仅1株检测出tdh基因,测序验证为tdh2。结论1.提示分子检测方法的检出率均高于国标法,分子检测方法之间差别不大。2.三种分子检测方法均高灵敏度,能最大程度发现阳性标本,且有很高的阴性预测值,但特异性、阳性预测值等指标较低。尤其是敏感性高的Real-time PCR和LAMP法,更容易产生假阳性结果。3.三种检测方法操作简便,检测快速,尤其是LAMP法,所需仪器少,极具基层推广性,推荐作为副溶血性弧菌检测的初筛方法。4.广州市海产品中存在tdh阳性Vp菌株,提示其为引起食物中毒的潜在病原。5.在Vp环境分离株的整合酶基因特征研究上,需加大标本数量和设计多中心调查来得到确切结论。