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目的 冠心病的发病率在当今世界上占首要地位，冠状动脉硬化性心脏病是造成缺血性心脏病最常见的病因，心肌缺血的基本矛盾是对氧的供需失调，近年来一些研究表明，发现钙离子(Ca2+)与心肌细胞缺氧损伤密切相关，钙离子在冠心病发生过程中起重要作用。既往治疗冠心病所使用的钙拮抗剂多针对外钙内流途径，缺乏选择性，有易耐药等副作用，因此，从内钙释放途径入手研究心肌缺氧的防治措施将是一个新的突破。1978年就有报道延胡索治疗冠心病的药理研究，还发现其中脱氢紫堇碱（Dehydeocorydaline，DHC）有明显的活性，而对DHC在心血管方面的机理研究甚少，尤其在分子生物学水平的研究，国内、外尚未见报道。本文首先建立和改良稳定的乳鼠心肌细胞的分离和培养方法，提高了心肌细胞的单细胞收获率、存活率及搏动率。其次探讨了脱氢紫堇碱及维拉帕米（verapamil，Ver）对豚鼠心肌细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)变化的影响。最后，从心肌细胞、分子和基因水平研究脱氢紫堇碱对心肌细胞内Ca2+超负荷及Ca2+调控蛋白的作用机制。 方法 原代心肌细胞的分离与培养纯化：在Simpson培养法的基础上，将乳鼠一棒击法处死，迅速取出心脏，去除结缔组织及脂肪组织，将心脏剪成3-5mm的碎块，应用胰蛋白酶消化法分离心肌细胞，用形态学、台盘兰染色法及心肌细胞肌动蛋白荧光染色法鉴定心肌细胞，来探讨一种新的改良方法，并建立了乳鼠心肌细胞原代培养的新模型。 脱氢紫堇碱对正常和缺氧豚鼠心肌细胞内钙的影响：采用离体豚鼠心脏Langendorff法灌注，胶原酶I型分离心肌细胞，用荧光指示剂方法（Fure一2/AM）标记心肌（〔ca“+」，）变化。将心肌细胞悬液分为3组，对照组、DHC组、Ver组。给予纯氮气缺氧500秒（P。:7.7一13.3kpa），观察缺氧后心肌[eaZ+〕，的变化。 Ca，‘调控蛋白mRNA水平变化的分析:采用RT一PCR方法对心肌细胞上存在caZ十调控蛋白的mRNA在转录水平的改变进行了检测，首先将心肌细胞（2 x 10‘/瓶）用DEPe处理的PBS洗2次，加人TRIzol试剂Zrnl，室温下震荡smin，加人0.4耐的氯仿，摇动巧秒，并放置室温下2一3min，离心巧而n（1200鲍，4℃），此时，分为三层:最低层为红色的酚一氯仿，中间层，无色的上水层，小心吸取上水层，加人异丙醇1而，离心10min（1200鲍，4℃），去除上清，加入乙醇Znil，震荡后，再离心5而n（75O0g，4℃），倒掉乙醇，为细胞的总RNA，然后，用TaKaRa RNA PCR屹t合成cDNA，条件为30℃一10min，50℃3omin，99℃一5而n，5℃一5而n。继而行PCR扩增，条件为:94℃预变性smin，95℃变性30See，56℃退火30See，循环35次，在延伸6min，72℃延伸3min。扩增后的产物经PAGE电泳检测，mRNA相对表达水平计算公司为:mRNA相对表达二样品扫描值/样品日一actin扫描值。 Ca，十调控蛋白蛋白表达水平变化的分析:处理后的细胞，PBS洗后离心，加人200林l的裂解液，超声粉碎后，离心60而n（120009，4℃），吸取上清后，考马斯亮兰测定法定蛋白。10.5%SDS一PAGE电泳，BIORAD电泳板，双板条件为:150V，30MA.然后，转印于硝酸纤维素膜，经2h、50V的转印，件BS洗膜三次，每次5而n，5%BSA封闭50而n，TTBS洗2次，转到ea，‘调控蛋白蛋白抗体中，4℃过夜，转到辣根过氧化酶标记的大鼠抗小鼠的二抗中，孵育Zh，最后，用ECL检测。检测了心肌细胞的两种基因:RYR和肌集钙蛋白的蛋白表达改变。结果 （l）单细胞收获率为25%;（2）分离、消化后即刻、第二日、第四日及第六日的细胞存活率分别为（75 .8士22.5）%、（87.4士20.5）%、（92.9士2一8）%、（93.6士21.2）%;第五日、第六日的细胞搏动率分别为（92.1士19.3）%、（91 .8士18.1）%，上述各项指标均高于Simpson法，（3）证明心肌细胞传代在l一5代之内仍使心肌细胞保持其原有的生物学特性。（4）正常氧状态心肌［CahL均值为 120．5。8．3nmoUL＊＝20人门)正常氧条件下，DHCJer均使心肌［ Cak人朋显下降。N)缺氧状态下，心肌Kah」增加与缺氧时间（程度）呈直线相关，相关系数r为0．98左右。门)DHC对缺氧后心肌［Ca卜十j；增加有明显延缓。堆)缺氧导致心肌细胞的Cah－ATPase、磷酸受钠蛋白人一型钙通道和肌集钙蛋白的mRNA转录水平明显减低师＜0．01X但却使 RyR的 mRNA转录水平明显升高h＜0．05人”)DHC引起正常、缺氧心肌细胞的 RyR与肌集钙蛋白的 mRNA转录水平明显变化h＜0．01入其中 RyR转录水平明显减低，而肌集钙蛋白的 mRNA转录水平明显增加。并且，肌集钙蛋白mRNA转录水平的增加与RyR的mR－NA转录水平下调显著相关（r二 0．7＊，p＜0．05）。（10）DHC它使正常和缺氧状态下的RyR的蛋白表达降低保肌集钙蛋白的蛋白表达相对含量明显增加（p＜0．05）。 结 论 门)用改良法培养乳鼠心肌细胞时，单细胞收获率高、细胞存活率高。使心肌细胞和非心肌细胞分离彻底，提高了心肌细胞纯度，故认为改良后的方法是比较理想的心肌细胞培养方法。四川HC在正常氧、缺氧条件下?