论文部分内容阅读
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是重要的食源性致病菌之一,因其表达多种肠毒素（Staphylococcal Enterotoxins,SEs）引起食物中毒（Staphylococcal food poisoning,SFP）而危害巨大。肠毒素A（Staphylococcal enterotoxin A,SEA）被认为是导致葡萄球菌食物中毒最主要的肠毒素,约80%的食物中毒事件与SEA有关。SEA耐受性强,在通过高热处理、胃蛋白酶和胰蛋白酶消化作用后仍有催吐活性。因此,通常的烹饪和食品加工方法不能完全将其灭活,为其引起食物中毒提供了可能。近年来,在许多亚洲国家发现食物中毒与ST6型金黄色葡萄球菌有关。在中国,ST6型更是葡萄球菌食物中毒的首要菌株系,且具有表达SEA和葡萄球菌蛋白A（spa）基因为t701型两个主要特征。此外,ST6-t701在我国健康人群和食品中也有检出。因此,本研究针对不同地理区域的医院相关人员和环境、食品及加工链、动物以及食物中毒等来源菌株,对其进行特征分析,而后筛选出产SEA金黄色葡萄球菌,着重研究其表型特性和分子特性,揭示其肠毒素表达情况和影响因素,探索生物膜形成的影响因素,并对ST6-t701菌株进行全基因测序,寻找致病相关遗传因子,探讨致病规律,为揭示我国金黄色葡萄球菌食物中毒规律提供理论基础。本研究主要获得以下结果:（1）不同来源金黄色葡萄球菌对抗生素耐受性存在差异,SFP源性菌株耐药性相对较低,而人源性菌株其耐药重数和耐药率显著较高;菌株携带较多溶血毒素基因hla、hld和杀白细胞毒素基因luk ED;SFP源性菌株携带毒素基因种类最多,携带8种以上毒素基因显著高于人源性和食源性菌株,其中携带sea和see基因比例显著高于人源性和食源性菌株;不同来源菌株spa类型主要有9种（59.3%）,其中t091型和t701型为主要类型;有89.7%的菌株存在溶血特性,其中以α型和α+β型居多,分别占38.2%和27.6%;与食源性菌株相比,SFP源性和人源性菌株的spa型有重叠较多,结果揭示了SFP源性与人源性菌株存在较大关联。（2）通过sea基因筛选和ELISA验证,从食物、食物中毒和人及相关环境超过10913份样本中筛选出产SEA金黄色葡萄球菌共108株,未从动物源样本中筛得;产SEA金黄色葡萄球菌最主要ST和spa型为ST1型（t127,t321）,ST5型（t002,t311,t570）和ST6型（t304,t701）,且ST6型是SFP源性和食源性菌株最主要ST型,而ST239型和ST6型是人源性菌株中最常见的ST型;产SEA菌株携带多种毒素基因,肠毒素基因（除sea外）主要为see（98.1%）,溶血素基因主要为hld（99.1%）和hla（94.4%）,杀白细胞毒素基因主要为luk PV（80.6%）,最主要的是毒力基因谱为sea-see-hla-hlb-hld-hlg-hlgv-luk ED-luk PV（18/108,16.7%）,同时也是SFP源性主要毒力基因谱（33.3%）;菌株分为16个主要PFGE簇,97.4%的ST6型在同一簇,高度同源且与来源无关,说明ST6型菌株基因组较为保守;有85.2%产SEA金黄色葡萄球菌表现出对至少一种抗生素耐受,且分别有15.8%食源性、21.5%SFP源性和71.5%人源性为多重（≥3）耐药菌株,人源性菌株耐药率和耐≥4重抗生素比例显著高于食源性和SFP源性菌株;MRSA检出率为15.7%,全部分离自人源性样本,主要分子类型为ST239-t037。（3）产SEA金黄色葡萄球菌通常表达多种经典肠毒素,SEA-SED-SEE（83.3%）是最常见的经典肠毒素表达谱;ST6型菌株SEA的产生量显著高于ST1型和ST5型;多种营养物质和理化条件不同程度影响肠毒素的表达,大于和小于1%Na Cl浓度、葡萄糖浓度升高抑制肠毒素表达,低pH（酸性）比高pH（碱性）对肠毒素抑制作用大;低温（≤10℃）对肠毒素表达存在抑制作用。（4）对群体感应分子自动诱导肽（autoinducing peptides,AIPs）通过HPLC-MS/MS检测,12h为四种分子的最优检测时间点;附属调节基因（agr）类型、AIPs类别和ST型三者具有非常紧密的关系,鉴定为agrⅠ型分子的菌株检测到表达AIP-Ⅰ型信号分子,且对应的主要ST型有ST6、ST7、ST239、ST398和ST59型,鉴定为agrⅡ型分子的菌株检测到表达AIP-Ⅱ型信号分子且对应ST5型,鉴定为agrⅢ型分子的菌株检测到表达AIP-Ⅲ型信号分子且对应ST1型;产SEA菌株中没有检测到AIP-Ⅳ型信号分子,但从非产SEA菌株发现spa-t2091菌株均能检测到AIP-Ⅳ型信号分子;高表达SEA的ST型具有最高的AIP-Ⅰ型信号分子检测量,SEA表达量较低的ST5和ST1型菌株产生的AIP-Ⅱ和AIP-Ⅲ型信号分子量也相对较低。（5）产SEA金黄色葡萄球菌的生物膜形成能力受多种营养成分的影响,6%-9%的Na Cl浓度显著促进生物膜形成,并且通过场发射扫描电子显微镜观察到可见的丝状胞外分泌物质;葡萄糖和蔗糖抑制菌体生物膜形成,低浓度麦芽糖和乳糖（<5.6%）促进生物膜形成,随着浓度增大起到显著抑制作用;产SEA金黄色葡萄球菌生物膜形成能力受温度和pH的影响,≤10℃时生物膜形成能力弱,28℃、37℃和42℃生物膜形成无显著差异。（6）对一株ST6-t701食物中毒来源菌株（Wang1）进行全基因组测序。与参考菌株相比,Wang1菌株携带相对较少的毒力基因种类。通过对主要毒力基因序列进行比对发现,Wang1菌株毒素基因序列保守性较好;经比对发现sea基因属于sea1高表达序列,luk M和hlb核苷酸与参考菌株差异较大,且luk M的氨基酸序列变化相对较多,可能导致其蛋白毒力改变。